IL METODO BORDIGNON- PARMIANI - TEST DI SENSIBILITA' ALLERGENICA INDIVIDUALE

TEST DI SENSIBILITA' ALLERGENICA INDIVIDUALE

(METODO BORDIGNON-PARMIANI)

 

Nella diagnostica allergologica in vivo l’entità della risposta cutanea che si ottiene con una preparazione allergenica dipende essenzialmente da due fattori: la potenza dell’estratto allergenico cioè la concentrazione allergenica presente, e la sensibilità cutanea individuale (1).

Poiché lo scopo fondamentale di un estratto allergenico è quello di rendere possibile la diagnosi di una sensibilizzazione minimizzando il rischio di errore diagnostico, cioè di un falso negativo, è evidente che l’estratto allergenico debba avere una “elevata” concentrazione, cioè più sensibile che specifico, cercando comunque un equilibrio tra la massima percentuale di veri positivi e la minima percentuale di falsi negativi. Questa scelta viene sostenuta dagli studi di dose-risposta che evidenziano come alle prove cutanee variazioni anche consistenti di concentrazione non determinano significative variazioni di risposta cutanea (2, 3). In termini quantitativi l’area del pomfo aumenta di 2-2,5 volte per un incremento di 10 volte della concentrazione allergenica (4).

La sensibilità cutanea individuale è assai variabile. Varia con l’età aumentando fino alla terza decade e poi diminuendo (5, 6, 7, 8); varia con il sesso essendo i maschi più reattivi (9); varia nella giornata avendo un ritmo circadiano (10, 11), varia in base alla sede corporea utilizzata (12, 13), e varia dal periodo dell’anno in cui si effettua la valutazione (14, 15).

Il comportamento della sensibilità cutanea individuale poi nei confronti di un allergene è assai variabile: infatti la quantità di allergene necessaria ad indurre un pomfo identico a quello che si ottiene con 1 mg/ml di istamina può variare  fino a 10.000 volte in pazienti diversi (16).

La risposta cutanea dipende inoltre dal metodo utilizzato (17), dal tipo di lancetta o di strumento impiegato (18), dalla manualità dell’operatore (16, 17).
Attualmente il metodo più utilizzato è rappresentato dal prick test in quanto è relativamente privo di rischi, poco costoso, semplice da eseguire e da valutare,  e correla bene con la storia clinica individuale quando vengono usati allergeni purificati e standardizzati (19, 20, 21, 22).

Nella valutazione complessiva di un paziente, una risposta cutanea positiva ad un allergene non corrisponde di per se alla presenza di una sensibilizzazione, in quanto vari studi epidemiologici hanno riscontrato valori percentuali dal 9 al 71% di positività in soggetti cosiddetti “normali”, privi di qualsiasi manifestazioni atopica (5, 23, 24, 25, 26, 27, 28).
Questo fatto può essere spiegato sia per errori di tipo diagnostico come variazioni nella tecnica, nella potenza allergenica o nella valutazione del risultato, sia come manifestazione di una allergia latente o di una pregressa sensibilizzazione clinicamente insignificante (29).

E’ del tutto evidente pertanto che anche un perfetto protocollo clinico-diagnostico non sempre è in grado di dare risposte valide ad alcune situazioni presenti nella pratica allergologica:

 


1)- pazienti diversi evidenziano per lo stesso allergene identiche risposte cutanee senza avere un quadro clinico-anamnestico sovrapponibile;
 

2)– ad un aggravamento clinico-sintomatologico in genere correlato ad una esposizione allergenica più o meno importante, non si ha una corrispondente variazione della pregressa risposta cutanea;
 

3)– in alcuni individui, soprattutto con patologie croniche rinitiche, una eventuale positività cutanea non è in grado di determinare la presenza o meno di una vera sensibilizzazione;
 

4)– in uno stesso individuo una risposta cutanea a più allergeni non riesce a definire una vera scala di sensibilizzazione tra le varie positività, non riesce spesso ad identificare il vero allergene responsabile della maggior parte delle manifestazioni atopiche presenti in quel soggetto;
 

5)– la risposta cutanea al prick test non è in grado di esprimere una reale diminuzione della risposta cutanea allo stesso allergene dopo una corretta immunoterapia.
 

Per tali motivazioni il nostro studio si è indirizzato alla ricerca di un test che utilizzando i normali estratti allergenici commerciali potesse individuare la dose più piccola dello stesso allergene in grado di dare una vera risposta cutanea (pomfo di almeno 7,1 mmq) (19) per quel soggetto e per quell’allergene.
Da qui il concetto di end-point o di sensibilità minima allergenica individuale.
Ci siamo orientati ad un comune metodo del laboratorio di immunologia: la diluizione per raddoppio in micropiastra (serie di 12 diluizioni 1:2 ) dove il risultato con una variazione di due successive diluizioni viene considerato come significativo (30, 31). Come estratti allergenici la scelta è caduta su estratti standardizzati con contenuto definito degli allergeni maggiori (32).

 IL TEST

METODO_BORDIGNON_-_PIASTRA_01

METODO_BORDIGNON_-_PIPETTA_02

 

  

  

  

  

  

  

  

 

MATERIALE NECESSARIO

 micropiastra con 96 pozzetti fondo a U

 micropipetta da 25 microlitri

 soluzione fisiologica sterile

 allergene standardizzato

 un po' di pratica e buona volontà

 

  

METODO_-_01_-_PRIMO_STEP_X_INTERNET

 I° STEP - Distribuire in ogni pozzetto 25 microlitri di soluzione fisiologica sterile

 

METODO_-_02_-_SECONDO_STEP_X_INTERNET

II° STEP - Nel primo pozzetto si depone 25 microlitri dell'allergene in studio, con un volume totale di 50 microlitri

 

 METODO_-_03_-_TERZO_STEP_X_INTERNET

III° STEP - Dopo aver ben mescolato , di questi 50 microlitri del 1° pozzetto 25 microlitri vengono deposti nel 2° pozzetto

 

METODO_-_04_-_QUARTO_STEPX_INTERNET

IV° STEP - Mescolare bene il contenuto del 2° pozzetto, e poi trasferirne 25 microlitri nel 3° pozzetto, ripetere la stessa operazione fino al 12°.

 

METODO_-_05_-_QUINTO_STEPX_INTERNET

V° STEP - si ottengono in questo modo le relative diluizioni per ogni pozzetto

 

Una goccia poi delle diluizioni relative ai pozzetti 2,4,6,8,10,12 viene posta al centro di ogni area costruita sull’avambraccio mediante linee parallele e ortogonali, separate l’una dall’altra di 4 cm in modo da evitare qualsiasi possibilità di riflesso assonico o di sovrapposizione di risposta eritematosa.

I pomfi con un’area minore di 7 mmq cioè con un diametro medio minore di 3 mm sono stati considerati negativi.

La riproducibilità del test è stata confermata riproducendolo in doppio e a distanza di una settimana l’una dall’altra. Anche alle diluizioni più elevate la riproducibilità non si modifica.


  

APPLICAZIONE N. 1 del METODO BORDIGNON- PARMIANI

LA VALUTAZIONE DELLA SENSIBILITA' ALLERGENICA INDIVIDUALE

Bordignon V,  Parmiani S.  Reproducibility and use of low-concentration skin-prick-test.

J Invest Allergol Clin Immunol 2000; 10(2):78-82

 

Nella valutazione di questo test 24 soggetti sono stati selezionati in base ad una positività al normale prick test con vari allergeni tutti positivi 4+ cioè con pomfo almeno doppio di quello dell’istamina.

L’esecuzione del prick test con tale metodica ha permesso di evidenziare:
a) - l’area del pomfo ottenuto con l’estratto commerciale non è predittivo dell’end-point. Soggetti sensibilizzati allo stesso allergene con area sostanzialmente uguale hanno evidenziato livelli diversi di positività all’end-point. Soggetti sensibilizzati allo stesso allergene con area del pomfo nettamente inferiore ad altri sensibilizzati allo stesso allergene hanno evidenziato livelli di positività anche superiori rispetto a quelli con area del pomfo nettamente superiori (Tabella I)

 

 aaa-tabella_1

TAB. I - Nessuna correlazione tra area pomfo ed end-point per lo stesso allergene 
  

b) – in 17 dei 24 soggetti si sono determinate anche le IgE specifiche per gli allergeni considerati. Non è stata riscontrata correlazione tra concentrazione delle IgE sieriche e il valore dell’end-point. Questo fatto rende ragione come la concentrazione delle IgE specifiche sieriche riflette la bilancia tra produzione e il tournover dell’anticorpo prodotto, mentre la reattività cutanea è determinata anche dal releasibility dei mastociti (34). (TABELLA II)

aaa-tabella_2

 TAB.II - Mancata correlazione tra end-point e IgE specifiche per lo stesso allergene


APPLICAZIONE N.2 del METODO BORDIGNON-PARMIANI

INDIVIDUAZIONE DELLE VARIAZIONI DELLA SENSIBILITA’ ALLERGENICA INDIVIUALE

Bordignon V, Parmiani S. Variation in skin reactivity to inhalant allergens estimated by end-point technique.

J Invest Allergol Clin Immunol 2001; 11(3):161-166

 

Si sono studiati 43 soggetti allergici di cui 22 per allergeni stagionali e 21 per allergeni perenni o allergeni a lunga pollinazione.
Si sono effettuati end-point per ogni allergene stagionale un mese prima e due mesi dopo il rispettivo periodo di pollinazione, mentre per gli altri allergeni prima e dopo dodici mesi esatti di distanza.
Si è così riscontato
- che nessuno dei soggetti in studio evidenziava una spontanea riduzione della sensibilità cutanea;
-  che 35/43 (p >0.0001) manifestavano un aumento della sensibilità cutanea quindi un aumento del livello di positività al test;
- che non esisteva alcuna differenza tra allergeni a breve stagionalità rispetto a parietaria e ad acari significando con questo che il processo allergenico indipendentemente dal periodo più o meno lungo di esposizione tende naturalmente a diventare sempre più “sensibile” raggiungendo nel tempo una specie di plateau da cui poi difficilmente potrà scendere se per quel soggetto perdurano le stesse condizioni di esposizione e quindi di reattività.
(FIG. 1 e FIG. 2)

METODO_BORDIGNON_-_06_-_DILUIZIONI__X_ALLERGENI__STAGIONALI_x_internet

 

 

 

METODO_BORDIGNON_-_07_-_DILUIZIONE_X_ALLERGENI_PERENN_x_internet

 


APPLICAZIONE N.3 del METODO BORDIGNON- PARMIANI

L'INDIVIDUAZIONE DEI  "FALSI POSITIVI"

 

Questo metodo consente anche di definire meglio i soggetti cosiddetti “falsi positivi”: sono quei soggetti la cui valutazione clinica e anamnestica non riesce a dirimere il quesito della presenza o meno di una vera sensibilizzazione clinicamente correlata.
L’esecuzione infatti del prick test ad alta diluizione permette di scoprire come questi soggetti rispondano solo alle dosi elevate di concentrazione (in genere il solo prick concentrato) rappresentando così quella variabilità di risposta cutanea presente in una qualsiasi popolazione all’allergene stesso.
Se ripetute prove di end-point effettuate dopo cicli di stimoli stagionali o di stimolazioni allergeniche continuative non evidenziano alcuna modificazione della reattività iniziale, questo fatto ci consente di dichiarare quel soggetto non reattivo a quell’allergene e quindi in senso lato non atopico (dati non pubblicati).

 


 

 


APPLICAZIONE N.4 del METODO BORDIGNON-PARMIANI 

STUDIO E DIFFERENZIAZIONE DELLE POLISENSIBILIZZAZIONI

Bordignon V, Parmiani S.  Differential diagnosis by the end-point method in patients skin-reactive to more than one inhalant allergen.

J Invest Allergol Clin Immunol 2002; 12 (4):272-278.

E’ ampiamente documentato che con l’età aumenta il numero delle sensibilizzazioni allergiche (37). E’ assai facile nella pratica allergologica riscontrare mediante prick test individui con positività a vari allergeni: ad es. una polisensibilizzazione a famiglie diverse di pollini è stata riscontrata nel 71,6% su 3567 pazienti pollinosici (38).
Non sempre la valutazione ambientale e le caratteristiche cliniche danno un valido aiuto all’allergologo per una scelta diagnostica e terapeutica più opportuna, come nelle riniti perenni.
Nella tradizione allergologica una relativa maggiore importanza viene data all’allergene che esprime il pomfo maggiore. Ulteriori sussidi diagnostici sono la determinazione delle IgE specifiche e i tests di provocazione specifici (congiuntivale, nasale e bronchiale) al fine di stabilire una gerarchia di importanza tra i vari allergeni.
E’ stato evidenziato ripetutamente come la correlazione tra IgE specifiche e la reattività cutanea per lo stesso allergene in uno stesso paziente sia scarsa utilità (39, 40).
Le prove di provocazione invero sono utili per pochi e ben selezionati casi in quanto richiedono molto tempo, appropriata strumentazione e personale addestrato; possono essere realizzate per un allergene alla volta e prima di procedere per un secondo allergene è necessaria una adeguata pausa.
Abbiamo studiato allora l’end-point come possibile test di riferimento in una situazione con 118 soggetti di cui 73 pazienti sensibilizzati al prick test concentrato a 2 soli allergeni e 45 pazienti con positività da 3 a 6 allergeni. L’esecuzione del test è stata eseguita nei periodi di assenza o di minima esposizione possibile all’allergene:
- gennaio febbraio per i polisensibili a graminacee, artemisia, lanciuola e olivo
- luglio per i polisensibili a gatto e acari
- settembre/ottobre per i polisensibili a  graminacee, betulla, nocciolo e artemisia
 
Dallo studio è emerso
- una correlazione significativa tra età dei pazienti e l’altezza dell’end-point: ad età più elevate corrisponde una maggiore reattività cutanea

- in 7 (tutti positivi a 2 soli allergeni)  sui 118 pazienti non è stata rilevata nessuna differenza negli end-points, mentre in tutti gli altri pazienti si è evidenziata una differenza da 2 a 10 diluizioni, quindi una differenza di sensibilità tra 4 volte a 512 volte. (TABELLA III)

 

AAA-TABELLA_3

TAB. III – Entità di variazione degli end-points nelle varie frequenze di pluriallergeni

 

- Nei soggetti positivi ad allergeni tra loro correlati , ad es. i due dermatofagoidi, i 2 mix graminacee, betulla e nocciolo, sono state riscontrate rispettivamente nel 79%, 88 % e 82,5 % variazioni nell’end-point differenze fino ad 8 diluizioni, vale a dire fino a 256 volte. (TABELLA IV)

AAA-TABELLA_4

TAB. IV – Variazioni nell’end-point tra allergeni tra loro correlati

 

- Inoltre interessante come in 60 su 118 pazienti che evidenziavano al prick test la più grande reazione cutanea non corrispondeva una uguale più elevata diluizione all’end-point, confermando ancora una volta la non correlazione tra valore del prick e la risposta all’end-point


Le considerazioni principali da trarre sono
- l’end-point rappresenta il necessario, indispensabile test nei casi di reattività cutanea a più di un allergene quando lo studio anamnestico o clinico non sia chiaramente a favore dell’uno o dell’altro
- l’end-point riesce nell’ambito degli stessi allergeni correlati ad evidenziare l’allergene maggiormente in causa nella patologia allergica sottostante
- l’end-point indica come nella pratica comune sia meglio utilizzare nella esecuzione i preparati per i singoli allergeni che non le loro miscele
 


APPLICAZIONE N.5 del METODO BORDIGNON-PARMIANI  

LA VALUTAZIONE DELL'EFFICACIA DELLA IMMUNOTERAPIA SPECIFICA

Bordignon V, Parmiani S.  Variation of the skin end-point in patients treated with sublingual specific immunotherapy.

J Invest Allergol Clin Immunol  2003; 13(3):170-176


L’efficacia clinica della immunoterapia specifica sia nella forma iniettiva che in quella sublinguale è stata riconosciuta dal WH0  (42). Abbiamo voluto studiare la variazione della sensibilità cutanea dopo vaccinazione sublinguale con il metodo dell’end-point in quanto con le metodiche tradizionali ben pochi sono gli studi che ne hanno evidenziato una riduzione (43,44,45).
Lo studio ha coinvolto 90 individui allergici a vari allergeni: raggiunta la fase di mantenimento si sono costituiti casualmente due gruppi : il Gruppo 1° è stato trattato con una sola goccia a somministrazione giornaliera, il Gruppo 2°  è stato trattato con lo schema per così dire “aziendale” cioè con un dosaggio di 5 gocce tre volte la settimana.
Dopo un periodo di due anni nel quale entrambi i gruppi sono stati trattati con la stessa terapia farmacologica, nei due anni successivi i due gruppi sono stati controllati nella assunzione volontaria o di  antistaminico, o di broncodilatatore eseguendo ogni anno il test di sensibilità
I risultati hanno evidenziato

 

1- che tutti i pazienti avevano ridotto di almeno 4 volte la reattività cutanea all’allergene sensibilizzante (TAB. V - * P<0.001) b="">

aaa-tabella_5

2- che oltre la metà dei soggetti avevano ridotto i farmaci almeno del 50% (TAB. VI )

*P=0.013 e  **P=0.001 per il  Gruppo 1  in confronto con il  Gruppo 2

 

 ● P<0.0001 in="" confronto="" a="" prima="" della="" slit="" b="">

 

aaa-tabella_6

 

3- che la correlazione tra diminuzione del consumo dei farmaci e la diminuzione della reattività cutanea risultava prossima alla significatività statistica;

4- che si rilevava una correlazione significativa tra età del paziente ed end-point cutaneo, come pure una correlazione positiva tra età del paziente e reattività istaminica.

5- che tra i due trattamenti quello con schema continuo (una goccia die del dosaggio massimo) dimostrava una maggiore riduzione della sensibilità cutanea ed una maggiore frequenza di non uso di farmaci (TAB. VII), confermando così come un minor dosaggio cumulativo otteneva un miglior risultato clinico rispetto ad un dosaggio cumulativo più elevato con lo stesso allergene (46).

aaa-tabella_7 


 

APPLICAZIONE N.6 del METODO BORDIGNON-PARMIANI 

VALUTAZIONE DELL'EFFICACIA DELLA SLIT IN BASE AL NUMERO DI SOMMINISTRAZIONI GIORNALIERI  DI UNA PICCOLA DOSE

(1/5 della dose consigliata dal produttore) 

 

Bordignon V, Burastero SE. Multiple day administrations of low dose sublingual immunotherapy in allergic rhinoconjunctivitis.

Ann Allergy Asthma Immunol 2006;97:158-163

 

Questo studio ha coinvolto 64 pazienti con una rinoconmgiuntivite allergica stagionale da pollini di graminacee e di betulla.

Sono stati divisi in tre gruppi per un periodo di 2 anni di trattamento con una dose di vaccino pari ad 1/5 della dose consigliata dalla ditta produttrice: un gruppo ("3-3") prendeva 1 goccia tre volte al giorno  per due anni; il secondo gruppo ("2-3") prendeva una goccia due volte al giorno per il primo anno e una goccia tre volte al giorno nel secondo anno; il terzo gruppo ("1-3") prendeva una goccia al giorno per il primo anno ed una goccia tre volte al giorno nel secondo anno.

In tutti i gruppi è stato valutato il consumo dei farmaci antistaminici  e la valutazione della reattività all'allergene usato nella SLIT mediante la tecnica dell'end-point.

Un gruppo controllo non effettuava nessuna vaccinazione.

La reattività cutanea all'allergene in trattamento comparata con il controllo si riscontrò ridotta dopo il primo anno di trattamento solo per il gruppo che utilizzava una goccia tre volte al giorno; al secondo anno una significativa ridotta reattività cutanea veniva riscontrata in tutti i gruppi trattati.

La riduzione dei farmaci venne dimostrata al primo anno sia nel gruppo con una goccia tre volte al giorno sia in quello con una goccia due volte al giorno. Alla fine del secondo anno la riduzione dei farmaci interessò anche il gruppo con una goccia die al primo anno e una goccia tre volte al giorno il secondo anno.

 

Questi risultati hanno dimostrato che la somministrazione anche di una dose più piccola (rispetto alla dose consigliata) ripetuta nella giornata induceva una significativa riduzione della sensibilità cutanea all'allergene trattato e una significativa riduzione dell'uso dei famraci antistaminici La riduzione della reattività cutanea risultava maggiore per lo schema di vaccinazione più frequente.

 

 

 

LA MIA  ESPERIENZA

 

E' dal 1996 ad oggi che utilizzo questo test e mantengo da allora verso  un qualsiasi soggetto con chiari segni clinici di allergia sia stagionale che perenne un preciso protocollo:

1°. anamnesi allergologica, visita allergologica generale, effettuazione delle classiche prove cutanee mediante prick sempre con l'utilizzo di allergeni standardizzati

2°. effettuazione del test di sensibilità allergenica per tutti gli allergeni che si sono dimostrati significativi, vale a dire con un pomfo superiore a 3,0 mm di diametro medio. Tale valutazione viene eseguita per i pollini due volte (prima dell'inizio della stagione pollinica di riferimento e a distanza dalla medesima, in modo da evidenziare un eventuale aumento delle IgE specifiche con l'aumento della sensibilità allergenica, vale a dire ad una positività di una maggiore diluizione; mentre per gli allergeni perenni a distanza di 10-12 mesi

3°. nei confronti dell'allergene che si è documentato "più sensibile"  rispetto agli altri oppure già alla prima valutazione evidenzia sensibilità elevate (es. diluizione 1:256 od oltre) viene iniziata una immunoterapia  con il minimo dosaggio disponibile (con il flacone alla concentrazione più bassa) somministrando una goccia mattino e sera (tale somministrazione si è dimostrata molto più realizzabile rispetto a tre volte al giorno)

4°. se non si evidenzia nessuna variazione della sensibilità (in aumento) o il livello di sensibilità rimane nei controlli successivi entro i valori della diluzione 1:2 o 1:4, si ritiene che una immunoterapia non sia necessaria, e in questi casi si cerca di ridurre l'eventuale stato infiammatorio delle alte vie respiratorie spesso presente per fattori costituzionali, ambientali o secondari a fattori lavorativi, a fattori voluttuari o a infezioni o a reflusso gastro-esofageo.

5°. per tutti i soggetti sottoposti ad immunoterapia ogni sei mesi circa  viene ripetuto il test di sensibilità individuale per quell'allergene e se la sensibilità si riduce (quindi la diluizione diviene più bassa) si prosegue con la stessa dose in atto, se invece la sensibilità rimane elevata si procede con un dosaggio superiore e così via, in modo che il trattamento sia conseguente alla risposta individuale ottenuta;

6°. nell'arco di 3 anni (spesso anche meno nei bambini) si riesce con questo metodo a portare la sensibilità alla sola diluizione 1:2 . Raggiunta questa sensibilità e mantenuta per tre controlli successivi, l'immunoterapia viene terminata.

 

CONCLUSIONI

 

In tutti questi anni ho eseguito sicuramente alcune migliaia di volte questo test, permettendomi di conseguenza di inviduare i veri soggetti che necessitavano di immunoterapia specifica e di eseguire questa terapia in modo del tutto personalizzato  (e non standard per tutti come avviene ancora oggi) in circa un migliaio di soggetti. 

Posso affermare con certezza (dati non ancora pubblicati)

a. di aver portato tutti alla sensibilità allergenica individuale più bassa (diluzione 1:2) nei confronti di qualsiasi allergene sia esso polline, acaro, muffa o derivato epidermico  

b. di aver ripetuto per almeno un centinaio di soggetti  questo test  a distanza di  7-10 anni dal termine di questa immunoterapia personalizzata e  di aver  sempre riscontrato la stessa sensibilità raggiunta 7 -10 anni prima. 

 

Spero veramente che altri allergologi armati di buona volontà  possano effettuare e valutare questo metodo, sicuro che in questo metodo l'allergologo troverà uno strumento eccezionale di qualificazione professionale  alla pari ad es. delle prove spirometriche per un pneumologo o di un ECG per un cardiologo.

 

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