02B - GLI ALLERGENI : CARATTERI SPECIFICI


GLI ALLERGENI

di VASCO BORDIGNON

Nella trattazione degli allergeni, i concetti visti negli “antigeni” si sovrappongono.

Gli Allergeni vendono definiti come le sostanze capaci di dar luogo ad una reazione IgE-mediata, differenziandosi dagli antigeni che identificano tutte le sostanze in grado di sensibilizzare un soggetto, dando origine a reazioni immunologiche di vario tipo, anche non IgE-mediate.

Classificazione

La più semplice è la classificazione in base alla modalità  con cui il soggetto viene ad esporsi 

1. allergeni da inalazione : pollini, muffe, dermatofagoidi, ecc.

2. allergeni da ingestione : alimenti, farmaci, ecc.

3. allergeni da iniezione o da puntura : farmaci, veleni di insetti, ecc.

4. allergeni da contatto: cosmetici, metalli, ecc.

Gli allergeni sono delle proteine o delle glicoproteine o degli apteni (quali sostanze chimiche semplici coniugati ad una carrier  cioè una proteina di supporto) con un peso molecolare tra i 5 e i 150 kDa e punto isoelettrico tra 2-10. Di queste proteine analizzeremo gli aspetti più importanti.

 

Il concetto di  MASSA o Peso Molecolare per gli allergeni e metodiche di rilevazione

Gli allergeni vengono descritti mediante una misura diversa da quella del numero di amminoacidi: si utilizza  il concetto di massa o di peso molecolare (PM).

Questa deriva in parte dal numero di aminoacidi, ciascuno dei quali "pesante" circa 110 g / mole.  L'unità di massa delle proteine ​​è il kilo-Dalton,  abbreviato in kDa (o kD),  ed 1 kDa è quasi uguale a 1 kg/mole. Per esempio, un peptide di 10 aminoacidi ha una massa di circa 1,1 kDa = 10x110/1000.

Gli allergeni hanno PM che vanno da 3,5-4 kDa a più di 150 kDa.

Il PM di un allergene non è la somma esatta dei suoi aminoacidi in quanto dal sistema ribosomiale vengono spesso apportate delle  modifiche  appena dopo la loro sintesi, quale ad es . una glicosilazione, cioè  la fissazione di zuccheri più o meno complessi in  precisi luoghi del polipeptide, ottenendo così una proteina glicosilata, una glicoproteina. L'aggiunta di queste catene di carboidrati appesantisce la proteina. Ciò è evidente, per esempio, confrontando un allergene glicosilato allo stato naturale e il suo equivalente in forma di ricombinante da E. Coli: non potendo il batterio glicosilare la proteina, quest’ultima sarà di qualche kDa più leggera rispetto alla proteina naturale. Ci sono anche allergeni che allo stato naturale si presentano sotto due forme, una glicosilata e l’altra non glicosilata: questo è il caso, ad es., per l'allergene maggiore del polline di olivo, Ole e 1, che ha un PM di 20 kDa quando è glicosilato e 18,5 kDa quando non lo è.

Per quanto riguarda il PM, infine, dobbiamo ancora distinguere tra PM effettivo e il PM apparente, quella che si osserva con le tecniche di separazione elettroforetiche quali "SDS-PAGE”.  Conosciamo questa tecnica di SDS-PAGE (elettroforesi in gel di poliacrilamide in presenza di Sodio Dodecil-Solfato)

 

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La mobilità elettroforetica delle proteine dipende dal peso molecolare, dalla carica elettrica e dalla conformazione spaziale. L’uso del tensioattivo anionico sodio dodecil-solfato (SDS) determina una alterazione della conformazione spaziale delle proteine,  formando complessi SDS-catena polipeptidica la cui carica elettrica e dimensione spaziale sono proporzionali al peso molecolare della proteina.  In questo modo la mobilità elettroforetica sarà inversamente proporzionale al peso molecolare o massa.

La SDS-PAGE si esegue solitamente impiegando due gel di poliacrilamide a diverso pH: il gel a pH intorno a 6,5, posto sul lato catodico in prossimità del punto in cui si posiziona il campione di estratto,  mentre il gel a pH intorno a 8,7 svolge la funzione di separatore.  Nel tampone si può aggiungere una sostanza riducente (di solito mercaptoetanolo), allo scopo di rompere i ponti disolfuro tra residui di cisteina. Alla fine della corsa elettroforetica, le proteine più mobili (cioè a PM minore) saranno quelle più vicine all’anodo.

La posizione delle proteine può essere resa visibile mediante colorazione con Blu di Coomassie (sensibilità  ~1 mg) o con sali di argento (sensibilità ~ 0,1 mg).

Eseguendo in parallelo una corsa con un mix di proteine a PM noto, con funzione di standard di riferimento, è possibile desumere dai tracciati informazioni sulla massa o  PM di ciascuna proteina presente nell’estratto.

E ’frequente riscontrare nei risultati pubblicati il concetto di "banda" IgE-reattiva di x kDa, oppure, nei tests di cross-reattività, la scomparsa di una “banda” di y kDa, presente prima di aggiungere l'inibitore.

Questi PM osservati in SDS-PAGE sono puramente indicativi e non possono essere utilizzati come tali per identificare questo o quello allergene.

Il PM apparente dipende dalle condizioni di lavoro, prima di tutto dal pre-trattamento o meno dell’estratto (o dell’allergene) con un agente riducente. La migrazione delle proteine ​​è alterata quando ciò che costituiva una sola molecola si trasforma dopo trattamento con l’agente riducente in 2 o 3 pezzi, significando che la proteina originale era  data da un assemblaggio di sub-unità legate da ponti disolfuro (ponti "SS ").

Succede anche che due allergeni si trovino sovrapposti nello stesso luogo (= con lo stesso PM apparente), e che si interpreti  impropriamente le corrispondenti IgE-reattività. Questo è stato il caso per due allergeni del lattice  Hev b 7 e Hev b 13, i quali, tutti e due, migrano a 42-44 kDa.

Per questi motivi vengono sempre di più utilizzati sistemi di separazione "bidirezionali".

Essi combinano una separazione elettroforetica su SDS-PAGE con una separazione in un'altra direzione, basata sul principio di elettro-focalizzazione. Quest'ultima separa le macromolecole in base al loro punto isoelettrico (il loro pI), vale a dire il luogo in un intervallo di pH dove la macromolecola evidenza  tanti ioni+ quanti ioni -.

Vediamone la tecnica e i risultati della ISOELETTROFOCUSING (IEF).

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E’ una elettroforesi eseguita in gel di poliacrilamide o agarosio, in presenza di anfoliti, cioè di sostanze capaci di creare, sotto l’azione del campo elettrico, un gradiente di pH tra il catodo ed anodo. Le proteine, per effetto dello stesso campo elettrico, migreranno nel gel finché il pH locale determinato dall’anfolita sarà uguale al loro punto isoelettrico (pI = pH al quale le cariche elettriche positive e negative della molecola si compensano, annullandosi).

Azzerata così la carica elettrica della molecola, diventerà pari a 0 anche la sua mobilità elettrica con il risultato che ciascuna proteina si troverà alla fine della procedura nel punto in cui il pH locale corrisponde al suo punto isoelettrico.

La visualizzazione delle proteine separate si effettua come in precedenza,.

 

 

Le tecniche sommariamente descritte fino a questo punto rappresentano solo il primo passo verso la definizione dello spettro allergenico dell’estratto, in quanto separano le proteine presenti senza differenziare in alcun modo quelle con caratteristiche allergeniche rispetto alle altre.

IMMUNOBLOTTING

La identificazione degli allergeni dovrà sfruttare la loro capacità di legare IgE specifiche provenienti da un pool di soggetti clinicamente sensibilizzati alla fonte da cui derivano.

Poiché questo non è tecnicamente possibile nei gel elettroforetici, le proteine separate con una delle procedure dette sopra sono trasferite su una membrana porosa adatta ad essere incubata con l’anticorpo (tecnica generalmente definita come Western blotting).

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L’incubazione con anticorpi anti-IgE umane marcate (con isotopi radioattivi o enzimi), seguita da autoradiografia o incubazione con il substrato specifico dell’enzima, permetterà la visualizzazione delle proteine allergeniche. La presenza, posizione ed intensità delle macchie così ottenute rappresenterà lo spettro delle proteine allergeniche presenti nel materiale in esame.

La sequenza polipeptidica

 

La caratteristica più utilizzata per descrivere o confrontare le proteine è la sequenza polipeptidica, cioè, quali sono gli amminoacidi che costituiscono il polipeptide cominciando dall'amminoacido N-terminale (quello che, alla fine, è legato tramite la sua funzione acida all’amminoacido successivo).

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La scrittura di questa sequenza utilizza le lettere per designare aminoacidi. 

 Nel caso di Hev b 6,02, l’Eveina del latice, abbiamo la seguente simbolizzazione della sequenza polipeptidica, con numerazione  a partire dal amminoacido N-terminale: 

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La sequenza in amminoacidi definisce la struttura primaria della proteina. Questa è la firma della proteina.

 

Le Isoforme di uno stesso allergene sono caratterizzate da alcuni differenti aminoacidi qua e là sulla sequenza, con quest'ultima tuttavia nel complesso similare.

Si parla di "conservazione” degli aminoacidi per quelli che sono identici nella stessa posizione sulla catena polipeptidica. Ci si serve della sequenza aminoacidica  per comparare gli allergeni tra di essi o per comparare un allergene noto con una proteina la cui allergenicità è ancora sconosciuta. Si realizza  così  un "allineamento di sequenza".

Riprendendo l'esempio dell’Heveinea del  lattice, la comparazione di sequenze con la porzione N-terminale (detta il "dominio Hevein ') di 2 allergeni alimentari che crociano con l’Eveina viene illustrata qui sotto: si opera un allineamento della sequenze. 

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Sono qui rappresentati in rosso gli aminoacidi che sono identici tra le tre sequenze. In Blu sono stati evidenziati gli amminoacidi che differiscono nelle due chitinasi in raffronto con Hev b 6.02. La proporzione di questi aminoacidi identici permette di calcolare una percentuale di identità e quest’ultima fa parte degli indici per una eventuale cross-reattività tra le due proteine ​​coinvolte.

In questi allineamenti di sequenza, è spesso necessario introdurre dei "buchi" qui contrassegnati con un asterisco *. Questi "buchi" non sono posizionati per ottimizzare le % di identità, ma per ricostruire al meglio il "motivo" (i motivi sono dei raggruppamenti caratteristici di strutture secondarie che si trovano con una certa frequenza in diverse  proteine).  In questo esempio  si può notare che gli aminoacidi identici  sono distribuiti da un posto all'altro lungo la catena polipeptidica, e molti hanno la lettera "C", il simbolo della cisteina. Come sarà spiegato più avanti, questo aminoacido svolge un ruolo importante per ottenere e mantenere la forma attraverso cui la proteina può svolgere un ruolo nell'organismo , cioè la struttura terziaria.

Gli altri aminoacidi non sono certo delle comparse: la loro natura e la loro posizione è importante sia per alcune proprietà della proteina (essi possono essere essenziali per il sito attivo nel caso di un enzima), sia  per il livello immediatamente superiore della conformazione di una proteina, la struttura secondaria.

 

I vari livelli di struttura proteica

e i determinanti allergenici

 

Ciascuno di questi allergeni (proveniente da pollini, acari, muffe, alimenti, ecc.) contiene di norma varie strutture che chiamiamo determinanti antigenici  o epitopi. Questo fatto viene chiamato multivalenza immunologica.

L’Epitopo è rappresentato da una sequenza di 8-15 aminoacidi, che viene riconosciuta da uno specifico anticorpo (IgE, IgG…). In pratica l’entità molecolare più piccola riconoscibile dal sistema immunitario.

Nel nostro campo i determinanti antigenici sono quelli allergenici, cioè riconosciuti dalle IgE specifiche. Esempio per capirci: non esistono anticorpi specifici (= IgE) per il latte (che rappresenta la fonte degli allergeni) né per la caseina o per le altre proteine presenti nel latte (che sono le proteine allergeniche del latte) ma solo per i determinanti epitopici o della caseina o delle altre proteine del latte.

Gli epitopi, come già ricordato precedeentemente per gli antigeni, possono essere

- epitopi B: riconosciuti dai B linfociti

- epitopi T: riconosciuti dai T linfociti

- lineari  o continui (in genere epitopi T) quando le IgE riconoscono una sequenza di aminoacidi contigui presenti sulla struttura primaria dell’allergene . Come già accennato la struttura primaria di una proteina non è altro che l’ordine con cui gli aminoacidi si susseguono nella catena polipetidica. Quindi la struttura primaria si identifica con la sequenza aminoacidica e tale sequenza è rigorosamente immutabile per ogni particolare proteina di un organismo.

- conformazionali o discontinui (soprattutto epitopi B) quando la sequenza degli aminoacidi riconosciuta dalle IgE non è contigua, ma definita dalla struttura tridimensionale della proteina. Il numero e il tipo di questi epitopi conformazionali sono spesso poco conosciuti.  Tratti più o meno lunghi della catena polipeptidica tendono ad assumere tre diverse tipologie stabili quali ad alfa-elica, a beta-foglietto  e ad anse o ripiegamenti (loop).

I ripiegamenti della catena fanno sì che elementi della struttura secondaria vengano a trovarsi vicini gli uni agli altri: catene laterali R dei residui aminoacidici possono interagire fra loro formando legami deboli che tendono a stabilizzare la conformazione tridimensionale della proteina (struttura secondaria), come pure possono formarsi legami covalenti (ponti disolfuro S-S ) fra due catene laterali di residui di cisteina, dando un notevole contributo alla stabilita della struttura terziaria. Importanti comunque per questa stabilità sono anche  le interazioni delle catene laterali con il solvente (l’acqua).

Non tutte le proteine hanno questi ripiegamenti.

Alcune adottano una conformazione imprecisa e si presentano sotto forma di una catena allungata e deformabile. Questo è il caso, per esempio, delle glutenine presenti nei  semi di frumento o per le caseine del latte. Questa conformazione allentata facilita la formazione di reti macromolecolari a causa della esposizione di molti aminoacidi in grado di formare legami tra una molecola e l’altra ed è inoltre meno suscettibile al deterioramento degli epitopi a seguito del  riscaldamento della proteina.

Si conoscono anche delle proteine miste per la presenza di una parte della loro molecola con una struttura secondaria ben definita ed un’altra che non lo è  per niente. Ad es. Art v 1, il principale allergene del polline di assenzio selvatico (Artemisia vulgaris), presenta un lungo dominio C-terminale associato ad un dominio N-terminale ripiegato, globulare.

Il ripiegamento delle proteine fornisce loro una economia termodinamica, vale a dire, una migliore stabilità, che viene raggiunta compiutamente con  il ripiegamento della molecola su essa  stessa (il cosiddetto ”folding"). Un esempio: la  Bet v 1 del polline di betulla. Questo ripiegamento conferisce alla proteina una forma più o meno globulare acquisendo così la sua struttura terziaria. (come da immagine sottostante)

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La presenza di cisteine è essenziale per generare questa la struttura compatta in quanto  questi aminoacidi si associano 2 a 2 per formare dei ponti  disolfuro , o "ponti SS", che resistono molto bene all’aggressione termica. Più una proteina possiede cisteine ​​lungo tutto il polipeptide e più essa è in grado di formare ponti SS che favoriscono la sua stabilità.

Lo schema sottostante mostra un esempio di piccole proteine ​​ricche di ponti  S-S  (una LTP e una 2S albumina), di una proteina priva di ponti  SS ( una PR-10 o  Bet v 1-like) e di una proteina che ha dei ponti SS solo su una parte della sua  catena (chitinasi di classe 1): 

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La presenza di questi ponti SS determinerà in gran parte la modificazione della conformazione della proteina dopo il riscaldamento (per esempio cottura) e, allo stesso tempo, il mantenimento o meno di epitopi B funzionali.

Le LTP (Pru p 3 nella pesca ad esempio) e le 2S albumina (es. Ara h 2 nelle arachidi) mantengono la loro reattività IgE anche dopo il riscaldamento, mentre le PR-10 (ad esempio mela) evidenziano una IgE-reattività fortemente ridotta e così anche le chitinasi ( ad es. l’avocado).

Questi cambiamenti possono essere rallentati quando la proteina è "protetta" da un ambiente favorevole, spesso dei grassi, come è stato osservato per PR-10 della soia o di arachidi.

La Proteolisi è, essa stessa, più facile con le proteine sprovviste di ponti SS.

Durante la digestione, una proteina  PR-10 viene rapidamente degradata, mentre il dominio Eveina delle chitinasi, ricche in ponti SS,  resisterà più a lungo.

Schematizzando, ci sono proteine ​​capaci di limitarsi ad una sindrome orale allergica allo stato crudo (ad e. Mal d 1, la PR-10 della mela), ci sono delle proteine ​​in grado di generare reazioni sistemiche in quanto parzialmente resistenti alla proteolisi, ma ancora sensibili al calore (per esempio la chitinasi della banana) e ci sono delle proteine ​​suscettibili di indurre facilmente reazioni sistemiche in quanto resistenti sia al calore e sia alla digestione (ad esempio, Pru p 3, la LTP della pesca ).

La struttura terziaria, e specialmente quella a livello degli epitopi B,  è un elemento chiave per comprendere le reattività o non le reattività crociate tra gli allergeni. Va sottolineato,  inoltre, che l'aggiunta di catene di carboidrati ai polipeptidi fin dalla loro sintesi ribosomiale partecipa ugualmente alla stabilità della struttura terziaria della proteina. Queste catene di carboidrati possono anche generare epitopi IgE-reattivi (vedremo in altro file).

La struttura terziaria inoltre è una componente fondamentale della allergenicità di molte proteine​​: infatti la conformazione spaziale gioca un ruolo importante nelle interazioni con quelle molecole che, alla superficie cellulare, riconoscono le proteine e decodificano la loro natura.

Ma l'organizzazione spaziale degli allergeni non è limitata ad un ripiegamento  della molecola su se stessa, perché,  per numerosi allergeni, la forma nativa è una associazione di polipeptidi: alcuni allergeni sono certamente dei monomeri ma derivano da un riarrangiamento al momento della loro sintesi: il polipeptide parentale (il "pro-peptide") viene scisso da proteasi in due o più pezzi, e questi pezzi si accoppiano 2 a 2 formando ponti SS. L'allergene è quindi composto da "sub-unità" collegate tra loro (ad es. la maggior parte delle 2S  albumine come  Ara h 2 dell’arachide).

Questo tipo di assemblaggio complica l'identificazione degli allergeni all’immunoblot quando quest’ultimo  viene eseguito dopo trattamento dell'estratto allergenico con un agente riducente. Quest’ultimo in effetti rompe i ponti SS e non si ritroverà  sulla migrazione la banda che ci si aspetta,  cioè al livello della massa totale dell’allergene: questo (allergene) migrerà sotto forma di bande con massa inferiore, che rappresentano le sub-unità della proteina.

Numerosi allergeni poi si presentano in natura come dimeri (due molecole collegate tra loro), o come trimeri (3 molecole) o esameri (6): profiline, Bet v 1, tropomiosine, alcune lipocaline (derivati epidermici di mammiferi), delle  polcalcines, vari tipi di proteine ​​di accumulo di riserva dei semi  ( trimeri per le viciline, esameri per  legumine), ecc .. ecc .. e sono così allo stato naturale sotto forme più complesse.

Questi assemblaggi rappresentano il livello superiore della struttura per gli allergeni: la loro struttura quaternaria.

La proteina illustrata qui sotto è Phl p 7, la polcalcina della Coda di topo o Codolina (una graminacea), ed è  un dimero.

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Non si sa bene che cosa  succede di questo assemblaggio dopo il contatto con paziente : si divideranno facilmente ? Si metteranno in evidenza degli epitopi che non erano evidenziabili (e quindi testabili) nella forma nativa ? Che cosa rimarrà dei dimeri, dei trimeri, ecc, negli estratti ?

La presenza di questi polimeri nel prodotto nativo potrebbe influenzare la risposta osservata nel corso dei prick-test : si può immaginare che un legame degranulante sia più frequente in un dimero rispetto ad un monomero dello stesso allergene in quanto il dimero permette sia legami eterogenei  (= 2 epitopi diversi sulla molecola monomerica) sia dei legami omogenei (=2 epitopi uguali nella molecola monomerica)  come schematizzato nella figura sottostante:

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Se così è,  si coprende come i prick tests con il prodotto nativo siano frequentemente più sensibili rispetto ai prick che utilizzano altri estratti.

Il riconoscimento di un allergene da parte delle  cellule effettrici (mastociti, basofili) o dalle cellule B è molto più conosciuto: questo riconoscimento  si realizza mediante un legame ad un epitopo della proteina per mezzo di una immunoglobulina presente sulla membrana cellulare. L'epitopo e la regione corrispondente sulla immunoglobulina, il paratopo, possono leggermente  migliorare la loro interazione nell’ambito di  un processo dinamico. Ma questa malleabilità ha dei limiti e, da parte dell’allergene,  la struttura terziaria  va a regolare, a governare la più o meno grande affinità dell’epitopo con la IgE. Si tratta di una "immagine 3D", che è ciò che il paratopo riconosce. (lo vedremo nel "processo di riconoscimento").

Gli epitopi B sono quelli più studiati, tuttavia per gli epitopi T sappiamo:

 - che sulla proteina non sono obbligatoriamente sovrapposti agli epitopi B;

 - che dipendono poco dalla conformazione nativa della proteina;

 - che possono essere situati nelle zone interne della proteina;

 - che possono essere oggetto di un legame crociato a livello delle cellule T, come le cross-reattività di due epitopi B contrapposti sulla stessa IgE

 - che presentano una grande variabilità di posizionamento sulla proteina da un paziente all’altro

Questa variabilità individuale è stata riscontrata anche per gli epitopi B.

Così non solamente i pazienti differiscono gli uni dagli altri per i loro contatti con questo o con quel prodotto allergizzante (es. polline, acari, animali, alimenti, ecc.) ma anche perché non si sensibilizzano tutti allo stesso prodotto, neppure agli stessi allergeni presenti in un dato prodotto, nè alle stesse isoforme di un dato allergene, nè agli stessi epitopi di uno stesso allergene!

Un lavoro di Fujimura del 2004 evidenzia con chiarezza questa eterogeneità :

- nel siero di 40 pazienti pollinosici si sono evidenziate non meno di 131 “macchie” differenti all’immunoblot del polline del cedro del Giappone (Criptomeria japonica);

- il numero di pazienti che riconoscevano la stessa macchia varia da 1 a 31 a seconda delle macchie;

- il numero delle macchie riconosciute dalla stesso paziente varia da 4 a 86; 

- e le 12 isoforme di Cry j 1 erano evidenziate in una percentuale molto variabile (nel 27 al 5% dei casi) anche se queste isoforme hanno tra di esse una forte omologia.

 

Metodiche di individuazione della presenza

e della posizione degli epitopi B su un allergene

 

Classicamente possiamo utilizzare vari metodi:

- dividere la proteina in vari pezzi e poi su ciascuno di essi determinarne la residua IgE-reattività. In base ai punti di rottura, vale a dire a seconda del tipo di proteasi utilizzata, possiamo trovare delle zone che conservano in tutti i casi una IgE-reattività: queste rappresentano i “punti caldi” della IgE-reattività della proteina;

- realizzare una modificazione puntiforme di uno o di alcuni aminoacidi allo scopo di controllare una eventuale modifica della IgE-reattività. Queste tecniche di mutazione mirata utilizzano comunque proteine ricombinanti;

- studiare la sequenza lineare della proteina, quindi sintetizzare vari corti peptidi (circa 12 aminoacidi) che rappresentano così nel loro insieme la copia  dell’intera proteina da un capo all’altro. Tutto questo rappresenta la “mappatura degli epitopi”.  Per non perdere nessun epitopo, i peptidi vengono sovrapposti gli uni con gli altri , si parla di “peptidi sovrapposti”: vedi esempio sottostante.

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Ma queste tecniche di ricerca degli epitopi B hanno un grave difetto: non rispettano la conformazione nativa della proteina.

Tuttavia, ad oggi, gli esperti sono d’accordo come nella maggior parte dei casi gli epitopi B non sono lineari ma conformazionali.

 

Che cos’è un epitopo conformazionale?

 

Come già detto, un epitopo è conformazionale quando gli aminoacidi necessari alla sua IgE-reattività non sono vicini l’uno all’altro lungo la sequenza peptidica. Viene anche detto epitopo “discontinuo”.

E’ il ripiegamento della proteina su se stessa a causare l’avvicinamento degli aminoacidi precedentemente distanti gli uni dagli altri.

Un epitopo conformazionale corrisponde quindi ad un’area della superficie  della proteina.

Le caratteristiche spaziali di questi epitopi sono molto importanti e una modifica che coinvolge un aminoacido (ad es. una mutazione mirata) o  l’equilibrio tridimensionale della proteina (es. effetto del calore) sono suscettibili di alterare la capacità dell’epitopo di legarsi alle IgE.

Per le proteine che non subiscono trasformazioni prima del loro contatto con il paziente, è preferibile determinare gli epitopi B scostandosi il meno possibile dalla forma nativa dell’allergene. Ciò interessa in modo particolare i pollini aerotrasportati o aerodiffusi.

Una tecnica cerca di rispondere a questa esigenza: è la “presentazione fagica”o "phage display". Questa metodologia associa mezzi informatici e test di laboratorio.

In sintesi:

- si inizia nel selezionare le IgE che si legano all’allergene da testare; quindi si testano queste IgE con una “biblioteca “ di batteriofagi filamentosi che alla loro superficie esprimono corti peptidi di qualsiasi sequenza;

 - i cloni dei batteriofagi che dimostrano una IgE-reattività vengono selezionati e poco a poco purificati;

 - l’analisi del loro DNA identifica la sequenza degli aminoacidi del peptide presentato. Quest’ultima viene quindi riportata su un modello in 3D dell’allergene; la coalescenza di queste zone IgE-reattive sulla superficie dell’allergene definisce la posizione dell’epitopo conformazionale.

Questa tecnica è di grande importanza in quanto permette di conoscere meglio le similitudini, le affinità responsabili delle reattività crociate tra gli allergeni e possibilmente anche di predire eventuali IgE reatività per nuove proteine; consente di individuare gran parte delle regioni IgE-reattive, evidenziando anche con chiarezza che gli epitopi sono prevalentemente formati dall’avvicinamento di molteplici corte sequenze IgE-reattive sulla superficie della proteina. 

La rappresentazione secondo un modello 3D permette quindi una caratterizzazione più pertinente, più vera degli epitopi B.

Essa aiuta così a comprendere le sottili differenze che modificano la IgE-reattività di proteine che  sono nel complesso molto simili. Ciò vale anche per la reattività crociata. 

 

Fonti documentali alla fine della sezione n. 02