04C - LA SENSIBILIZZAZIONE - LE CITOCHINE - LA FAMIGLIA DELLE CHEMOCHINE

CHEMOCHINE : RUOLO NELLA SENSIBILIZZAZIONE

di Vasco Bordignon

Sono una grande famiglia di citochine, strutturalmente omologhe, il cui nome deriva dalle due radici “chemotassi” e “citochine”.
Alcune chemochine sono prodotte da vari tipi di cellule in risposta a stimoli infiammatori e richiamano i leucociti nelle sedi di infiammazione.
Altre chemochine sono prodotti in vari tessuti dove regolano il normale traffico leucocitario in assenza di flogosi.
Finora sono state identificate oltre 50 chemochine, che aumenteranno sicuramente nel corso degli anni.


CLASSIFICAZIONE

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Strutturalmente le chemochine sono dei polipeptidi del peso molecolare di 8-12 kD, nei quali al loro interno vi è la presenza di 3 o 4 residui cisteinici  altamente conservati [= struttura rimasta uguale nel corso della evoluzione], che partecipano alla formazione di due ponti disolfuro.
Possono essere suddivise  in 4 famiglie in base alla posizione dei residui cisteinici N-terminali che partecipano alla formazione dei ponti disolfuro, in base al numero di aminoacidi (X) presenti tra la 1^ e la 2^ cisteina,  e in base alla loro localizzazione cromosomica.
Tra i membri di una sub-famiglia vi è una identità aminoacidica dal 30 al 90%; mentre tra le sub-famiglie l’identità aminoacidica scende sotto al 30%:

La sub-famiglia C-X-C

E' caratterizzata dalla separazione delle prime due cisteine da un aminoacido variabile.  Le chemochine CXC possono essere divise in due sottogruppi: quello che contiene ELR e quello che non lo contiene. ELR è un motivo (=struttura ripetitiva) aminoacidico conservato  (Glu-Leu-Arg) che precede immediatamente il primo residuo di cisteina.

Le chemochine ELR (CXCL1, CXCL2, CXCL3, CXCL5, CXCL6, CXCL7, e CXCL8) sono angiogeniche [=stimolano la formazione di nuovi vasi] e agiscono prevalentemente attraverso il recettore CXCR2. Al contrario le chemochine non-ELR (CXCL4, CXCL9, CXCL10, CXCL11 e CXCL17) sono angiostatiche [=sono capaci di bloccare la formazione di nuovi vasi] e agiscono principalmente attraverso il recettore CXCR3B.  Questo gruppo non-ELR di chemochine può essere indotto da diversi interferoni.

Eccezione a questo è CXCL12 che non è una chemochina non-ELR ma è tuttavia angiostatico e si lega al CXCR4 sulle cellule endoteliali.

La sub-famiglia C-C

Nella sub-famiglia C-C i residui di cisteina sono adiacenti l’uno all’altro.

La maggior parte delle chemochine conosciute finora sono comprese  nelle sub-famiglie CxC e CC.  Questi due gruppi, inoltre, possono essere distinguibili dai loro principali bersagli cellulari: la sub-famiglia C-X-C ha come bersaglio i neutrofili,  mentre la sub-famiglia C-C ha come bersaglio eosinofili, monociti e linfociti T.

La sub-famiglia C 

Una terza famiglia di chemochine, chiamata sub-famiglia C, ha  solo un singolo residuo cisteinico. Tale sub-famiglia comprende il peptide chemotattico linfocito-specifico XCL1(o linfotactina).

La sub-famiglia CX3C

Una quarta sub-famiglia CX3C ha i 2 residui cisteinici N-terminali separati da 3 aminoacidi diversi.

Nei soggetti umani questa famiglia ha solo un membro, CX3CL1 (fractalkina) e la sua unicità sta nel fatto che possiede una specie di “gambo” glicosilato simil-mucinoso che consente di esistere sia come chemochina solubile sia come chemochina legata alla membrana.


RECETTORI E SEGNALI DI TRASDUZIOINE


Il numero dei recettori sulla superficie cellulare varia da 3000 per cellula sui monociti e linfociti per CCR1 e CCR2  e da 40000 a 50000 per cellula negli eosinofili per CCR3.
Il numero dei recettori può variare in base all’ambiente  circostante e in base ai segnali che la cellula riceve.
Una determinata cellula può esprimere diversi recettori chemochinici, ognuno dei quali può indurre specifici segnali, suggerendo che ciascun recettore può dare segnali attraverso strade diverse.
Ulteriori complessità dell’azione recettoriale sono emerse di recente con la dimostrazione che CXCR4 e CCR5 possono divenire eterodimeri [=formati da due subunità diverse] e trasmettere un segnale composto quando stimolato dai loro rispettivi ligandi.

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I recettori accoppiati a proteine G sono formati da un unico filamento proteico che attraversa sette volte la membrana plasmatica. Vi sono tre tratti (chiamati loops o anse) extracellulari e tre intracellulari.

La capacità di dare il segnale attraverso differenti percorsi è dovuta in parte alle proprietà dei recettori accoppiati alle proteine G (o GPCR), che sono costituiti da una singola catena polipeptidica (che può essere costituita anche da 1100 residui) costituita da 7 α-eliche che attraversa 7 volte la membrana plasmatica (immagine sopra).  A queste 7 alfa-eliche si aggiungono 6 anse idrofiliche (3 extracellulari e 3 citoplasmatiche) di collegamento tra le alfa-eliche.  L’estremità amino-terminale è extracellulare, quella carbossi-terminale è intracellulare.  L’ansa intracitoplasmatica che collega la 5^ e la 6^ elica transmembrana (cioè la 3^ intracellulare) insieme ad un dominio della regione C-terminale forma il sito di legame per le proteine G. Questa stessa ansa e la coda C-terminale, inoltre, hanno degli aminoacidi di serina e treonina che rappresentano i siti di enzimi fosforilanti importanti per la modulazione e la desensibilizzazione di questi recettori.

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In questa immagine si mostra un modello tridimensionale di recettore accoppiato a proteina G. Le Y presenti nella parte amino-terminale indicano i siti di glicosilazione, mentre le palline piene presenti in ambito intracellulare indicano i siti di fosforilazione. Si può vedere inoltre come il sito di legame per la proteina G, da cui dipende la specificità della risposta alla attivazione recettoriale, sia formato dalla III ansa intracellulare in combinazione con il territorio carbossiterminale.

Le proteine G sono un sottogruppo di una superfamiglia di GTPasi che vengono divise in GPTasi monomeriche e in proteine G eterotrimeriche , costituite da tre subunità proteiche α,β,γ, che vengono divise in due subunità: la subnità α e la subunità βγ.
La capacità di trasmettere il segnale attraverso diverse vie è dovuta in parte a questa struttura epta-elicale transmembrana dei recettori.
Un’ampia area di superficie, che consente interazioni con le subunità α e βγ delle proteine G eterotrimeriche e di altre molecole effettrici, viene creata attraverso un ripiegamento del recettore lungo la membrana plasmatica interna e attraverso l'orientamento laterale del terminale carbossilico.
Il segnale inizia dopo che la chemochina si è legata al recettore, il quale attiva fattori di scambio della guanina, permettendo la sostituzione della guanina difosfato  (GDP) con guanina trifosfato (GTP) nella subunità Gα. Il risultato è la dissociazione del complesso eterotrimerico della proteina G dal recettore e la separazione delle subunità Gα e Gβγ.
La subunità Gα è in grado di attivare direttamente la famiglia Src delle chinasi  [questa famiglia interagisce con varie proteine del citosol, nucleari e di membrana, modificandole attraverso la fosforilazione dei residui tirosinici] portando alla attivazione delle MAPKs [MAPKs = Mitogen-activated protein kinases; sono implicate nell’indirizzare le risposte cellulari dopo una gamma diversificata di stimoli quali mitogeni, stress osmotici, shock da calore e citochine pro-infiammatorie. Esse regolano la proliferazione, l’espressione genica , la differenziazione, la mitosi, la sopravvivenza cellulare  e l’apoptosi tra le molteplici altre azioni . MAPKs si trovano solo negli eucarioti, anche se, piuttosto diverse,  si riscontrano in tutti gli animali, funghi e piante, e anche in una matrice di eucarioti unicellulari] e della proteina chinasi B [la proteina chinasi B o PKB è una proteina del citosol che interviene nella fosforilazione di vari substrati proteici nei residui della serina e della treonina portando spesso alla loro inattivazione].
Il segnale mediato dalla subunità Gβγ è più complesso implicando almeno 3 separati percorsi. 
Gβγ può attivare la proteina chinasi B  e le MAPKs attraverso la fosfatidil-inositolo 3-chinasi γ e la PKC (o Protein Kinasi C ) attraverso la fosfolipasi C e Pyk 2 (= una tirosin chinasi citoplasmatica) .  L’attivazione della  fosfolipasi C aumenta la concentrazione ionica intracellulare di calcio.  L’afflusso di calcio attiva vari processi cellulari, tra cui la degranulazione dei neutrofili, eosinofili, e basofili.
Vi sono anche  altre vie di attivazione delle chemochine che esulano dal nostro interesse.
I segnali mediati dalle proteine G terminano quando un gruppo fosfato viene rimosso dalla guanina trifosfato  legato alla subunità Gα ricostituendo la guanina difosfato. Ciò permette che le subunità Gα e Gβγ si ricongiungano e di porre fine alla cascata di attivazione dei segnali.
Le chemochine possono pure attivare vie di attivazione, quali MRPK e proteine tirosin-chinasi, attraverso meccanismi indipendenti dalla proteina G.
Si deve ricordare come i segnali mediati dai recettori delle chemochine possano anche essere oscurati attraverso vari meccanismi, quali ad es. le complesse desensibilizzazioni omologhe ed eterologhe.
In aggiunta ai recettori che attivano la risposta cellulare alle chemochine, altri 3 recettori si legano alle chemochine:
 
- Duffy antigen/chemokine receptor (DARC) conosciuto anche come Fy glycoprotein (FY) or CD234 (Cluster of Differentiation 234) :  è una proteina che nell’uomo è codificata dal gene DARC. L’Antigene Duffy è localizzato sulla superficie dei globuli rossi ed è così chiamato dal nome del paziente nel quale è stato scoperto. La proteina codificata da questo gene è una proteina glicosilata di membrana e si è riscontrato che agisce come un recettore non specifico per citochine delle famiglie C-C e C-X-C, facilitando soprattutto la trancitosi nelle cellule endoteliali. Questa proteina rappresenta inoltre il recettore per i parassiti della malaria  Plasmodium vivax e Plasmodium knowlesi. Il polimorfismo di questo gene è alla base del sistema Duffy dei gruppi sanguigni.
- D6.  Il recettore D6 si lega con relativamente elevata affinità alla maggior parte dei membri della famiglia C-C delle chemochine, ma non dimostra, dopo essersi unito al ligando, di avere una funzione recettoriale di segnale.  E’ stato dimostrato che D6 costitutivamente circola dentro e fuori la superficie cellulare per internalizzare e degradare chemochine.  Per questo viene incluso nella classe dei recettori delle chemochine conosciuti con recettori silenti delle chemochine o recettori “esca”. 

- CCX-CKR  o C-C chemokine receptor type 11 è una proteina codificata dal gene CCRL1,  e fa parte della famiglia dei  recettori accoppiati alle proteine G. E’ stato dimostrato che questo recettore si lega alla cellule dendritiche e ai linfociti T attivati dalle chemochine CCL19, CCL21 e CCL25.

Questi recettori si legano alle chemochine ma non sono veri segnali,  e per questo sono stati designati, come già  detto, come recettori “esca” (decoy receptors) . I recettori “esca” legano il ligando ma non danno la trasduzione del segnale e quindi impediscono che  il ligando diventi capace di agire.  In termini di azione delle chemochine, i recettori esca giocano un ruolo nello smorzare la risposta immune, portando poi alla risoluzione della infiammazione.
 

FUNZIONE DELLE CHEMOCHINE (cenni) 

La descrizione iniziale delle chemochine aveva focalizzato soprattutto il loro ruolo fondamentale nel processo di extravasazione o transmigrazione leucocitaria o diapedesi leucocitaria verso i siti della infiammazione.
In sintesi in un processo chiamato rolling o rotolamento, i leucociti interagiscono transitoriamente con l’endotelio vascolare, alla ricerca di segnali di attivazione provenienti dalle chemochine. Nel legame di una chemochina con il suo recettore, vengono espresse delle integrine, le quali mediano delle interazioni di alta affinità e portano all’arresto dei leucociti. Una volta che la cellula ha cessato il rolling, essa può attraversare l’endotelio e raggiungere la sede della infiammazione. In questa chemiotassi vi è l’espressione di particolari chemochine, recettori, e molecole di adesione che contribuiscono ad una selettiva migrazione e una specificità tissutale dei leucociti.
Le chemochine attuano una varietà di funzioni oltre quella della chemiotassi.
Le chemochine possono avere effetti diretti sulla differenziazione del T linfociti attraverso interazioni ligando-recettore sullo sviluppo cellulare, o indirettamente attraverso alterazioni del traffico delle APC (Antigen Presenting Cell) o sulla secrezione di citochine.
Funzionando attraverso il recettore CCR5, CCL3 (MIP-1α = Macrophage inflammatory  protein), e CCL4 (MIP-1β), e CCL5 possono promuovere linfociti  TH1 direttamente mediante IFN-γ  o indirettamente attraverso l’incremento della produzione di IL-12  dalle APC .
Invece CCL2 ( MCP-1 = Monocyte Chemoattractant Protein ), CCL7 (MCP-3), CCL8 (MCP-2) e CCL13 (MCP-4) possono inibire la produzione di IL-12 da parte delle APC e promuovere la produzione di IL-4 da parte di T linfociti attivati, portando al fenotipo TH2.
L’espressione del recettore delle chemochine può servire come marker della maturazione e della differenziazione dei linfociti.
Quando i monociti e le cellule dendritiche immature escono dal sangue nei tessuti e iniziano la immuno-sorveglianza, essi esprimono i recettori CCR1, CCR2,CCR5, CCR6 e CXCR2, che vengono classificati come recettori della infiammazione.
Come un antigene viene incontrato e le cellule dendritiche maturano, i recettori della infiammazione si riducono e sono rimpiazzati dalla espressione CCR7.  L’espressione di CCR7 permette alle cellule dendritiche di accumularsi nei linfatici di drenaggio e nell’area dei T- linfociti dei linfonodi.
L’espressione del CXCR5  è stato dimostrato trovarsi su un subset distinto di T-linfociti memoria, subset che manifesta funzioni di B-linfociti helper. Queste cellule rispondono alla CXCL13 (BLC) e sono dirette verso i follicoli B-linfociti per aiutare la produzione di anticorpi.
Il rilascio di neutrofili maturi del midollo osseo è regolato dal legame della CXCL12 con il recettore CXCR4.
Altri esempi includono il ruolo per CXCL1, CXCL12, e CCL3 nello sviluppo cerebrale; un ruolo per CCL2 e CXCL8 nella guarigione delle ferite e un ruolo nella organogenesi per CXCL12.


IMPORTANZA CLINICA nelle MALATTIE ALLERGICHE (cenni)


Una alterata regolazione della espressione delle chemochine è stata riscontrata in diverse malattie (immagine sottostante)

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Vari studi hanno dimostrato aumentati livelli di chemochine in pazienti asmatici rispetto a soggetti di controllo, come riscontrato nel lavaggio bronco-alveolare e nei campioni bioptici. Sono coinvolte CCL2, CCL3, CCL5, CCL7, CCL11, CCL13, CCL24, CXCL8, e CXCL10.

I ricercatori hanno utilizzato modelli murini di asma per comprendere il ruolo che le chemochine hanno nell’indurre  l’iperreattività bronchiale.
Tutte queste chemochine, CCL2, CCL5, CCL11, CXCL10 e CXCL12, contribuiscono alla iperreattività bronchiale e alla emigrazione cellulare in questi modelli di infiammazione delle vie aeree.
La famiglia delle chemochine C-C è stata ampiamente studiata nelle malattie allergiche per l’abilità di questi componenti di reclutare eosinofili, linfociti T e monociti verso le regioni di flogosi.
CCL5 e CCL11  rappresentano i più importanti chemoattraenti di eosinofili nelle infiammazioni allergiche. Ciò è stato dimostrato  nei topi, nei quali l’instillazione di CCL5 o CCL11 nei polmoni porta ad un infiltrato cellulare di eosinofili e di mononucleati in assenza di neutrofili.  
Oltre alla produzione da parte di eosinofili, macrofagi, mastociti e T linfociti, CCL5 e CCL11 sono prodotti da cellule strutturali delle vie aeree, incluse cellule muscolari lisce  e fibroblasti.
Oltre al tessuto linfatico, le cellule epiteliali nasali esprimono CCL17 (TARC) e l’espressione di questa chemochina e del suo recettore CCR4 si evidenzia più elevata in pazienti con rinite allergica rispetto a quanto riscontrato  in soggetti di controllo non allergici.
Sia IL-4 che IL-13 promuovono la espressione di CCL17, portando ad una risposta TH2.  Ciò è un elemento importante nella aspergillosi allergica broncopolmonare (ABPA : Allergic Broncho-Pulmonary Aspergillosis), nella quale aumentati livelli di CCL17 sono più predittivi di recrudescenza della malattia rispetto al livello delle IgE.
I livelli di CCL17 possono essere utilizzati come marcatori di ABPA in pazienti con fibrosi cistica.
CXCL8 proviene principalmente da fagociti mononucleati e da cellule epiteliali ed endoteliali, ma anche da linfociti T, eosinofili, neutrofili, fibroblasti, cheratinociti, epatociti e condrociti.
La sintesi di CXCL8 può essere indotta da LPS, IL-1, TNF o infezioni virali.
Su base molare, CXCL8 è uno dei più potenti chemoattraenti per neutrofili in aggiunta alla stimolazione della neutrophil respiratory burst  [= burst respiratorio od ossidativo indica il rapido rilascio di radicali liberi di ossigeno (superossido e perossido di idrogeno)] e all’adesione alle cellule endoteliali attraverso CXCR1.
CXCL10 e CXCL13 vengono indotte in tempi diversi dopo esposizione allergenica. CXCL10 viene prodotta nelle fasi iniziali dopo l’esposizione allergenica, mentre CXCL13 è indotta solo dopo una seconda e seguenti esposizioni allergeniche. Questo potrebbe avere a che fare con le fonti cellulari di queste citochine.
Le cellule epiteliali delle vie respiratorie producono CXCL10 e il contatto con gli allergeni può indurne l’espressione e così si spiegano gli alti livelli presenti precocemente dopo l’esposizione allergica.
CXCL13 viene prodotta dal linfociti TH17, ma non dai linfociti TH1 o TH2.
Si può ipotizzare che i linfociti  TH17 giochino un ruolo nell’asma nelle successive esposizioni dopo che si stato già ben stabilito il fenotipo allergico. (di questi linfociti TH17 TH1 e TH2 ne parleremo in altro lavoro)
I sub-sets dei linfociti T, che possono avere una attività regolatoria, sono stati identificati e chemochine e i loro recettori appaiono avere importanti ruoli nel mediare sia l’attività che la migrazione di queste cellule .
Tra i linfociti CD4+CD25+Foxp3+nTreg, è possibile che vi siano almeno 2 sottogruppi distinguibili sulla base  della loro espressione in CCR6. Quelli con elevata espressione in CCR6 sembrano avere attività regolatoria, mentre quelli con bassa espressione in CCR6 secernono citochine TH2 su stimolazione di super-antigeni batterici.
Un altro gruppo ha dimostrato bassi livelli di XCR1 sulla superficie di T linfociti CD4+CD25hiCD127low isolati in soggetti asmatici allergici in comparazione con quelli di soggetti sani come controllo.

Sebbene in stadi primordiali, questo campo emergente della risposta delle  chemochine e  della espressione da parte dei linfociti Treg [T regolatori] ,vi è speranza che si possa comprendere molte di queste questioni sulla modalità con la quale queste cellule lavorano.

Principali Fonti Documentali : fare riferimento al file "La sensibilizzazione.  I segnali cellulari: Recettore e Ligando".