04H - LA SENSIBILIZZAZIONE - LE CITOCHINE - LA FAMIGLIA TNF - TUMOR NECROSIS FACTOR

FAMIGLIA delle CITOCHINE  TNF (TUMOR NECROSIS FACTOR )


Membri di questa famiglia possono dare segnali di sviluppo, di attivazione o di morte.

La famiglia delle citochine Tumor Necrosis Family (TNF) regolano lo sviluppo, la funzione effettrice, e l’omeostasi delle cellule che entrano in gioco in vari sistemi tra i quali lo  scheletrico, il neuronale e l’ immunologico.

Le citochine della famiglia TNF possono essere solubili o legate alla membrana.

In generale esse sono rappresentate da proteine trans-membrana di due tipi: una con corta regione N-terminale intra-citoplasmatica ed un’altra con una più lunga regione C-terminale extracellulare. La regione extracellulare tipicamente contiene un normale dominio TNF-omologo responsabile dell’interazione con i recettori citochinici.

Membri di questa famiglia TNF possono agire anche come mediatori solubili, a seguito della scissione della loro regione extracellulare, e in vari casi la stessa citochina esiste in entrambe le forme sia come solubile che  legata alla membrana cellulare.

Vi sono due membri di questa famiglia che hanno lo stesso nome (eponimi): TNF-α e TNF-β,  anche se TNF-β è comunemente conosciuto come Linfotossina-α o LT-α.

Entrambi vengono secreti come proteine solubili.

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TNF-α

TNF-α (frequentemente riportata semplicemente come TNF) è una citochina pro-infiammatoria, prodotta principalmente da macrofagi attivati, ma anche da altre cellule inclusi i linfociti, i fibroblasti, e keratinociti  in risposta ad infezione, infiammazione e a fattori di stress ambientali.

TNF provoca i suoi effetti biologici legandosi ai suoi recettori, TNF-R1 e TNF-R2  che saranno descritti più avanti.

Linfotossina-α viene prodotta da linfociti attivati e può liberare una moltitudine di segnali. Legandosi ai neutrofili, alle cellule endoteliali e ad osteoclasti la linfotossina-α libera segnali di attivazione; in altre cellule, il legame della linfotossina-α può portare ad una aumentata espressione delle glicoproteine MHC e delle molecole di adesione.

Altre citochine fisiologicamente importanti di questa famiglia legate alla membrana cellulare sono:

-Linfotossina-β , conosciuta anche come TNF-C (tumor necrosis factor C) è importante nella differenziazione dei linfociti;

-BAFF  (B Cell Activatin Factor) e APRIL (a proliferation inducing ligand)  rappresentano due citochine importanti nel contesto dello sviluppo e dell’omeostasi dei B linfociti;

-CD40L, citochina espressa sulla superficie dei Linfociti T necessaria per indurre il segnale della differenziazione dei Linfociti B;

- il ligando Fas (FasL) o CD95L, che induce apoptosi legandosi al suo proprio recettore Fas o CD95.

Sia in forma solubile che in forma legata alla membrana, le citochine attive della famiglia TNF si assembrano in trimeri.

Sebbene nella maggior parte dei casi siano omo-trimeriche, si possono formare citochine etero-trimeriche all’interno dei membri della famiglia delle TNF  Linfotossina–α, e linfotossina–β e all’interno APRIL e BAFF.

 

TNF RECETTORI

I membri della superfamiglia dei recettori dei TNF sono definiti dalla presenza di domini ricchi di cisteina (CRDs = Cysteine-Rich Domains) nel dominio extracellulare, che si unisce al ligando. Ciascun CRD tipicamente contiene 6 residui di cisteina, i quali costituiscono tre  anse legate tra loro da ponti disulfuro, e ciascun membro della superfamiglia può contenere da uno a sei CDRs.

Sebbene la maggior parte dei recettori dei TNF siano proteine di membrana di tipo I (il loro N-terminale si trova al di fuori della cellula) pochi membri della famiglia vengono staccati dalla membrana per formare varianti recettoriali solubili.  Alternativamente, alcuni perdono del tutto il dominio di ancoraggio alla membrana, oppure si legano alla membrana solamente con  legami covalenti.

Queste forme solubili di recettori della famiglia TNF sono conosciuti come “decoy receptor” recettori esca, in quanto sono capaci di intercettare il segnale dal ligando prima che questo raggiunga la cella, bloccando effettivamente il segnale.

Questo è il discorso che si è incontrato antecedentemente per la famiglia dei recettori dell’IL-1.


La segnalazione attraverso i recettori della superfamiglia TNF

 

La precisa via di segnalazione attraverso i recettori della famiglia TNF non è ancora del tutto chiarita.  Una ragione per la quale queste vie sono ancora difficili da definire risiede nel fatto che lo stesso recettore TNF-R1 può trasdurre sia segnali di attivazione sia segnali che portano a morte, a seconda dell’ambiente locale cellulare e molecolare nel quale il segnale viene ricevuto. Non si conosce ancora quale sia il fattore scatenante che scambi il programma di segnalazione dalla vita alla morte.

Descriveremo dapprima la via pro-apoptosica (che porta alla morte) e poi vedremo come il  TNF-R1possa promuovere i segnali  sia di vita che di morte.


La segnalazione attraverso il recettore Fas


Alla fine di una risposta immune, quando il patogeno è stato completamente eliminato, e  il sistema immune necessita di eliminare il surplus di  linfociti generati nella lotta contro quell’invasore, i linfociti iniziano ad esprimere sulla loro superficie cellulare il recettore Fas della famiglia dei TNF (FasR).

Il FasR, e il suo ligando FasL, sono membri specializzati della famiglia dei recettori e delle citochine del TNF rispettivamente, ed essi lavorano assieme nel promuovere l’omeostasi linfocitaria. I topi con mutazioni sia dei geni Fas (nlr/lpr mice) o dei geni FasL (gil mice) soffrono di gravi malattie linfo-proliferative, indicando la loro incapacità di eliminare i linfociti che non servono più ad utili finalità.

Nell’interazione con altre cellule immuni che producono FasL, il recettore Fas trimerizza e trasduce un segnale all’interno della cellula che evidenzia il Fas, dando luogo alla sua eliminazione mediante apoptosi.

L’apoptosi o morte cellulare programmata è un meccanismo mediante il quale la cellula muore dall’interno: viene frammentata in vescicole legate alla membrana  che poi vengono rapidamente  fagocitate dai vicini macrofagi. 

Utilizzando tali vie ben controllate di apoptosi, l’organismo assicura che anche una minima  infiammazione sia associata ad una fine naturale di una risposta immune.

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procaspasi

L’attivazione della via apoptosica richiede l’attivazione delle caspasi: queste sono cistein- proteasi, che scindono, tagliano in corrispondenza di un residuo di aspartato.

Le caspasi vengono sintetizzate inattive (procaspasi) dal punto di vista enzimatico sotto forma di una singola molecola aminoacidica di 32-55 kDa.  Ogni peptide è formato da 3 domini: un dominio centrale catalitico  detto “p20” contenente il sito attivo (17-21 kDa); un dominio C-terminale da 10-13 kDa detto “p10”, e un prodominio N-terminale da 3-24 kDa chiamato Death Domain (DD). Alcune caspasi hanno una breve sequenza di unione tra p20 e p10.

Il Death Domain è membro delle famiglie dei recettori TNF e ha 2 sottodomini di funzioni diverse: DED (Death Effector Domain) e CARD (Caspase Recruitment Domain).

La funzione di questi domini è il reclutamento delle caspasi iniziatrici (vedi più avanti) nel luogo di formazione dei complessi proapoptosici . Il prodominio caspasico può essere lungo (>90 aa) o corto (20-30 aa). Le caspasi con prodominio lungo sono divise in due gruppi: le caspasi-1, 4, 5, 12, 13, 14 controllano la maturazione delle citochine e i processi infiammatori; le caspasi-2, 8, 9, 10 sono dette iniziatori dell’apoptosi e contengono dominio DED (caspasi-8 e 10) o dominio CARD (caspasi-2 e 9).

Il dominio CARD è contenuto anche nelle caspasi-1, 4, 5, 11, 12.

Al contrario le caspasi con dominio corto sono dette effettori o esecutori dell’apoptosi e sono le caspasi-3, 6, 7.

Ogni enzima caspasi è una cisteina proteasi che taglia in corrispondenza di un residuo di Aspartato. Il sito catalitico conservato ha sequenza consenso QACxG, la cui localizzazione è visibile nella immagine sovrastante , all’interno della subunità α. Le caspasi sono quindi generalmente responsabili del processo di inizio ed esecuzione dell’apoptosi.

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Con il legame di Fas a FasL si ottiene un raggruppamento (clustering ) dei recettori Fas. Ciò a sua volta promuove l’inter-reazione tra le loro regioni citoplasmatiche, che includono domini comuni con un numero di molecole di segnalazione pro-apoptosica chiamate domini di morte (DD =death domains). Questo tipo di interazione, tra domini proteici omologhi che esprimono affinità l’uno all’altro, viene riferita come interazione omotipica.

Come essi si legano l’uno all’altro,  i domini di morte proteici Fas raggruppati incorporano i domini di morte dalla proteina adattatrice FADD (Fas-Associated Death Domain-containing protein) . FADD contiene non solo domini di morte ma pure un tipo di dominio simile, chiamato a Death Effector Domain (DED). Questo, a sua volta, si lega omotipicamente ai domini DED della procaspasi-8, dando luogo ad un raggruppamento di molecole procaspasi-8.  Le molecole procaspasi-8 contendono l’enzima attivo caspasi-8, tenuto in uno stato inattivo mediante legame ai pro-domini.

La multimerizzazione delle molecole di procaspasi-8 sfocia in una reciproca scissione  dei loro prodomini  inducendo l’attivazione di caspasi-8.  Caspasi-8 quindi scinde diverse proteine bersaglio cruciali nella genesi dell’apoptosi.

Le proteine bersaglio della caspasi-8 comprendono le caspasi esecutrici -3 e -7 (che scindono e attivano nucleasi che conducono alla degradazione nucleare: DNA).

Il complesso di Fas, FADD, e procaspasi-8 è chiamato come DISC : the Death-Inducing Signaling Complex).

Il risultato ultimo dell’attivazione di questa cascata è la condensazione di materiale nucleare,

la degradazione del  DNA nucleare in 240 paia di basi, frammenti di acidi nucleici e la conseguente rottura della cellula in frammenti uniti alla membrana “facilmente digeribili”.

 

La segnalazione attraverso il recettore TNF-R1


Il recettore TNF-R1 è presente sulla superficie di tutte le cellule dei vertebrati, e, come il Fas, ha un dominio intracellulare di morte (DD = death domain).

Il legame del TNF al recettore TNF-R1 può portare a due veri differenti esiti: apoptosi (morte) o sopravvivenza (vita). Come ciò avvenga, non è ancora chiaro.

Il meccanismo con cui il legame del TNF porta all’apoptosi è leggermente diverso da quello che segue al legame Fas-FasL.


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a sx la via apoptotica

Come con FasL, il legame del TNF con il recettore TNF-R1 induce la trimerizzazione del recettore come pure una alterazione della sua conformazione , e  ciò dà luogo ad un legame del DD con una molecola adattatrice, in questo caso TRADD (TNFR1 associated death domain protein), nel lato  citoplasmatico della molecola del recettore.

Il TRADD fornisce ulteriori siti di legame per i componenti RIP1, una serina/treonina chinasi, della famiglia delle Receptor interacting protein (RIP) chinasi,  che si lega con propri DD,  e per TRAF2 (il TNF Receptor Associated Factor 2). Questo è conosciuto come Complesso I (complex I).

Questo complesso può dissociarsi dal TNFR a livello della membrana, e migrare verso il citoplasma  dove si lega alla proteina  Fas-Associated Death Domain-containing protein (FADD) già conosciuta.  FADD recluta pro-caspasi 8  come già descritto, risultandone la generazione di segnale apoptosico. Questo viene indicato come Complesso II (complex II).

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a destra la via della sopravvivenza

Diversamente dal precedente,  il legame della stessa molecola TNF  allo stesso recettore, TNF-R1, può dar luogo ad un segnale di sopravvivenza.

Nel percorso sopravvivenza TNF-mediato, la genesi dell’originale complesso di membrana  sembra iniziare nello stesso modo con cui inizia il percorso pro-apoptosico. Tuttavia nel caso del percorso sopravvivenza, il complesso contenente TRADD non si dissocia dalla membrana, ma piuttosto rimane alla superficie cellulare e recluta un numero di altri componenti, che includono le ligasi ubiquitine cIAP1 e cIAP2 (cellular Inhibitor of apoptosis 1 e 2)

Una volta che cIAP1 e cIAP2 si uniscono al complesso TNF-R1 a livello della membrana cellulare, essi reclutano le proteine LUBAC (Linear Ubiquitin Chain Assembly Complex), che fissano le catene lineari ubiquitine al RIP1.

RIP1 poliubiquinato si lega quindi al componente NEMO (NF-kappa-B essential modulator) del IKK (IkB kinase) come pure a TAK1 (TGFβ-Associated Kinase 1), che viene facilmente complessato con le sue proteine associate TAB come già descritto nella Famiglia dell’Interleuchina 1.

RIP1 e TAK1 attivano il complesso IKK, conducendo alla fosforilazione e alla distruzione di IkB, e susseguente attivazione di NF-kB (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells).  Una volta che NF-kB è completamente attivato, attiva l’espressione della proteina cFLIP (cellular FLICE (FADD-like IL-1β-converting enzyme)-inhibitory protein) che quindi inibisce l’attività della caspasi-8, e quindi arresta il percorso pro-apoptosico.

Come precedentemente descritto, il complesso TAK1 agisce pure nell’attivare il percorso delle MAP chinasi, che ulteriormente aumentano il segnale della sopravvivenza.

Le scelte tra sopravvivenza e morte che vengono effettuate a livello del recettore TNF-R1, dipendono dal risultato della gara tra la generazione di caspasi-8 attiva da una parte e dall’altra la generazione di cFLIP , l’inibitore caspasi-8. 


Principali fonti documentali: fare riferimento al file "La sensibilizzazione. I segnali cellulari: Recettore e Ligando".