04L - LA SENSIBILIZZAZIONE - LE CELLULE DENDRITICHE - GENERALITA'

LE CELLULE DENTRITICHE IN GENERALE

Le cellule dendritiche (CD) sono specializzate nel catturare, nel trasportare, nel processare, e nel presentare gli antigeni (gli allergeni ) ai linfociti T.

Il processo di sensibilizzazione comprende vari attori tra loro in costante comunicazione dalle cui azioni si realizza una polarizzazione verso i Th2 linfociti e la successiva produzione di anticorpi IgE specifici.

Dopo aver considerato come le cellule siano continuamente in comunicazione tra di loro attraverso le citochine e le chemochine, ora parleremo delle cellule dendritiche, cellule “chiave” nella comprensione della sensibilizzazione allergica.

Le cellule dendritiche (CD)rappresentano una popolazione eterogenea di cellule, che originano da precursori midollari.

Si sono individualizzati due grandi sotto-tipi, che si differenziano sia sul piano fenotipico che su quello funzionale: le cellule dendritiche mieloidi (mDC : myeloid Dendritic Cell) e le cellule dendritiche plasmocitoidi (pDC : plasmocytoid Dendritic Cells).

Sono distribuite in tutto l’organismo, particolarmente presenti nella pelle (dove vengono chiamate cellule di Langerhans in onore del loro scopritore Paul Langerhans nel 1868), nelle mucose  (naso, bronchi, tubo digerente, ecc. ), ma anche nei tessuti interstiziali. Per es. le CD dell’apparato respiratorio si riscontrano nello strato epiteliale a contatto della lamina basale ove si rinnovano ogni 36-48 ore, come pure nel parenchima polmonare ove hanno una emivita di circa 7 giorni,

Sono dotate di capacità migratoria, e per questo possono spostarsi dal sito di cattura degli antigeni verso i siti di interazioni cellulari. Le CD sono in grado di scatenare una riposta immunitaria, utile anche nella difesa antiinfettiva e antitumorale, ed inoltre sono implicate nei fenomeni di tolleranza importanti nell’impedire ad es. lo svilupparsi di malattie autoimmuni. Infatti una “cattiva “ presentazione , vale a dire una presentazione degli antigeni da parte di cellule dendritiche non funzionali, non induce alcuna risposta e induce una tolleranza immunitaria verso questi antigeni.

Origine e sottotipi delle cellule dendritiche (CD)

Le CD dell’epidermide, chiamate come detto anche cellule di Langerhans,  sono state poi identificate per le loro funzioni da Ralph Steinman e Zanvil Cohn solo nel 1973.

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Zanvil Cohn a sx e Ralph Steinman a dx

Queste cellule sono caratterizzate da lunghi prolungamenti citoplasmatici comparabili a dei dendriti (dendrites).

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cellule dendritiche: le prime immagini

Queste cellule sono molto efficaci nel catturare e nel processare gli antigeni, inducendo poi  risposte T effettrici.

Le cellule dendritiche originano da un precursore ematopoietico.

Nel corso della differenziazione midollare, i precursori si orientano sia verso la linea monocitaria sia verso la linea dendritica.

Il progenitore delle cellule dendritiche chiamato DCP (common-Dendritic Cell Progenitor) genera cellule dendritiche mieloidi o classiche, e cellule dendritiche plasmocitoidi.

In base a marcatori di superficie vengono divise in alcune sottoclassi (da Gill, 2012):

- mDCs (tipo 1) con i marcatori CD11c+, BDCA1+ (CD1c), MHC classe II (HLA-DR)+

mDCs (tipo 2) con i marcatori CD11c+, BDCA3+ (CD141), MHC classe II (HLA-DR)+

pDCs con i marcatori CD123+, CD11c-, BDCA2+, BDCA4+, ILT7+, MCH classe II (HLA-DR)+

Per quanto concerne il sistema HLA ne parlerò diffusamente più avanti.

[CD11c+: è una integrina β2 che lega il componente iC3b, che è un frammento inattivo del complemento; le integrine sono proteine di superficie coinvolte nelle interazioni tra cellula e cellula e matrice extracellulare e hanno una importante funzione ni fenomeni di adesione tra linfociti e le cellule che presentano l’antigene (APC)e anche nella aderenza alle pareti dei vasi sanguigni e nella migrazione nei tessuti dei linfociti e dei leucociti]

[BDCA 1+,. 2+, 3+, 4+ : Blood Dendritic Cell Antigen; rappresentano un set di vari antigeni identificati essere presenti alla superficie dei suddetti subset di DC (cellule dendritiche).  BDCA2 gioca un ruolo di ligando nella internalizzazione e presentazione antigenica. BDCA3 si è rivelato essere identico alla trombomodulina, ma il suo ruolo nelle DC è ancora sconosciuto. ]

[CD123 conosciuto anche come Interleukin-3 receptor]

[ILT7 : immunoglobulin-like transcript 7]

Le cellule dendritiche mieloidi sono considerate le cellule che per professione sono capaci di processare e di presentare gli antigeni, capaci di secernere grandi quantità di interleuchina 12 (IL-12). Esprimono pure molecole di co-stimolazione. Dispongono quindi di tutte le caratteristiche necessarie per l’attivazione dei linfociti T CD4+ e CD8+.

Le cellule dendritiche plasmocitoidi devono il loro nome alla loro somiglianza morfologica a dei plasmociti. All’inizio erano chiamate “cellule produttrici di interferone (IFN)” per la loro capacità di produrre grandi quantità di IFNα dopo attivazione.

In funzione della loro localizzazione anatomica si possono identificare vari sottotipi di CD. Ciascun sottotipo ha dei ruoli distinti nel controllo del tipo di risposta immune ed esprime recettori differenti per il riconoscimento dei microorganismi e degli antigeni.

Ad es. nella cute, esistono due tipi distinti di cellule dendritiche: le cellule di Langerhans  nella epidermide, e le cellule dendritiche interstiziali nel derma.

La classificazione delle CD può tener conto della loro origine, della loro localizzazione tessutale, del loro fenotipo e delle loro funzioni. Ciò che riflette l’eterogeneità di queste cellule rappresenta  la caratteristica essenziale della linea dendritica. Questa eterogeneità permette loro un adattamento funzionale al tipo di aggressione e al microambiente,  indispensabile per il funzionamento immunitario e indissociabile per il loro utilizzo in terapia.

Reclutamento delle cellule dendritiche (CD)

Le CD, come detto, sono molto numerose in tutti i tessuti a contatto con l’ambiente esterno, nei quali costituiscono una rete di cellule sentinella, particolarmente in seno all’epitelio mucoso (bocca, esofago, polmone, intestino,  vagina, utero, vescica…) e nella pelle, e si trovano in uno stato immaturo.

In questo stato esse dispongono di una grande capacità di riconoscimento e di cattura degli antigeni, ma sono deboli attivatrici dei linfociti T.

Le varie sottopopolazioni di cellule dendritiche non hanno la stessa proprietà di cattura antigenica. In realtà le pCD (cellule dendritiche plasmocitoidi) possiederebbero una capacità di cattura più debole rispetto alle mCD (Cellule dendritiche mieloidi).

Attivazione dei recettori delle cellule dendritiche (CD) o “segnali di danno” nelle patologie allergiche

Gli allergeni possono attivare le CD sia per meccanismi indiretti (es. superamento della barriera epiteliale, azioni di danno extra-allergici, ecc.) sia per meccanismi propri, intrinseci alla propria struttura molecolare (proteasi, glucani, ecc.).

Vediamo:

- dai caratteri propri degli allergeni che favoriscono il loro passaggio attraverso l’epitelio. Questi caratteri sono rappresentati dalla attività proteolitica presente negli allergeni maggiori di dermatofagoidi,  scarafaggi, funghi,  pollini, essendo state identificate varie proteasi quali cisteina-proteasi, serina-proteasi o aspartato-proteasi. Questi allergeni proteolitici all’interno della mucosa inducono un danno ed una infiammazione tessutale dando luogo ad una attivazione immunologica;

- per l’azione del fumo di sigaretta che induce a rotture paracellulari e ad una riduzione della resistenza al passaggio mucosale tanto che si riscontrano concentrazioni sub-epiteliali tre volte maggiori di allergeni rispetto ai non fumatori.

- per l’azione citotossica sull’epitelio bronchiale da parte di virus influenzali, di virus respiratorio sinciziale, di rinovirus alterando l’integrità delle tight junction e aumentando la permeabilità paracellulare. Tali alterazioni permangono anche nel periodo post-infettivo.

- per alterazioni  epiteliali presenti  in varie malattie come ad es.  nella dermatite atopica, nell’asma, nella rino-sinusite cronica poliposica, come pure nelle infiammazioni intestinali croniche  quali il morbo di Crohn.

- per un processo attivo, un processo diretto di captazione da parte delle stesse cellule epiteliali, come dimostrato ad esempio nella cattura dell’allergene maggiore della Betulla , Bet v 1, da parte di cellule congiuntivali epiteliali solo da parte di individui allergici alla betulla già dopo un minuto dal challenge. Ciò non si verificava in individui sani. Si ipotizza un trasporto attivo lipid-raft e caveolae dipendente, verosimilmente legato ad anticorpi specifici in quanto ciò che è stato evidenziato per Bet v 1 non avveniva per allergici alle graminacee e viceversa.

- per un meccanismo basato sul fatto che molti allergeni sono delle glicoproteine: queste possono essere riconosciute dalle PRR (vedi poco più avanti) per i carboidrati espresse sulle cellule epiteliali respiratorie con  conseguente  captazione degli allergeni. Altri studi poi suggeriscono un importante ruolo dei complessi carboidratici, in particolare dei beta-glucani, nell’evidenziare caratteristiche favorenti risposte Th2 verso tali allergeni.

I recettori di riconoscimento delle cellule dendritiche (CD)

Il riconoscimento avviene attraverso dei recettori chiamati PRR o PATTERN RECOGNITION RECEPTORS, che sono di 4 tipi

- Toll-like receptors o TLRs : a seconda del loro tipo, le TLR riconoscono dei lipidi o degli acidi nucleici e sono espressi alla superficie cellulare o nei compartimenti intracellulari.  L’espressione degli undici (finora) TLR identificati dipende dal sottotipo delle cellule dendritiche.

-  C-type lectin receptors o CLRs  essenziali al riconoscimento di funghi e batteri.  I recettori del gruppo delle lectine di tipo C (CLR) sono delle molecole che si fissano sulla parte carboidratica delle glicoproteine che giocano un ruolo di ancoraggio di diversi agenti patogeni.  Differenti tipi di cellule dendritiche esprimono differenti CLR: BDCA2 (Blood DC Antigen 2) per le pDC, la langerina/CD207 specifica delle cellule di Langherans, o DC-SIGN (DC-Specific Intercellular Adhesion Molecule-e-Grabbing Non-integrin) per le cellule dendritiche interstiziali.

-  nucleotide-binding oligomerization domain (NOD) leucine-rich-repeat containinbg receptors o NLRs : componenti centrali degli infiammasomi (rappresentati dall’assemblaggio di questi NLRs in complessi ad alto peso molecolare, detti appunto inflammasomi, che controllano la maturazione e la secrezione di interleuchine come IL-18 e IL-1b, le quali poi innescano la risposta al danno e alla infezione).  I recettori NLR rappresentano una famiglia che riconosce componenti  intracellulari dei microorganismi. Dopo il riconoscimento delle PAMP, le NLR attivano delle vie di segnalazione che portano alla produzione di citochine pro-infiammatorie.

- retinoid acid-inducible gene I protein (RIG-I) helicase receptor : anch’essi agiscono come PRR citoplasmatici dando inizio a risposte immuni di tipo innato in particolare verso infezione virali a RNA.

I PRR possono sostanzialmente riconoscere

- profili molecolari di agenti patogeni chiamati PAMPS  o Pattern Recognition Receptor microbici : ad es. LPS riconosciuto dal CD14

- profili molecolari di antigeni ad es. il recettore per il mannosio che interviene nella cattura dell’allergene maggiore del Der p1

profili molecolari di proteine endogene, di solito intracellulari, liberate dopo lesioni cellulari , dette DAMPS  o Danger Associated Molecular Patterns.  Le DAMPs includono le proteine dello shock termico (HSP9, le HMGB1 (High-Mobility Group Box 1 protein), la β-defensina e l’acido urico. Si ritiene che gli agenti tossici inalati, lo stress ossidativo, le infezioni, i prodotti di necrosi cellulare, l’ipossia, l’ipercapnia, la riduzione delle perfusione locale possono condurre alla liberazione di DAMPs ad es. nella BPCO.

RECLUTAMENTO DELLE CELLULE DENDRITICHE (CD)

Il reclutamento delle CD è dipendente pertanto da citochine e chemochine prodotte nel sito infiammatorio da parte delle cellule della risposta innata o dalle cellule dell’epitelio (come vedremo). Ciò può portare ad un aumento da 5 a 10 volte del numero delle cellule presenti in un dato sito.

Le cellule dendritiche immature esprimono un repertorio di recettori di chemochine che consente  loro di rispondere alle chemochine infiammatorie.

Le principali citochine e chemochine chemio-attrattive per le cellule dendritiche sono la GM-CSF (Granulocyte-Macrophage Colony Stimulating Factor) e la MIP-3α (Macrophage Infiammatory Protein 3α) o CCL20. Questi due fattori sono prodotti da tessuti infiammatori (in particolare dagli epiteli) o neoplastici.

Inoltre, le CD esprimono una varietà di recettori per stimoli chemiotattici diversi dalle chemochine, quali i segnali di “danno tessutale”. Questi stimoli sono prodotti rapidamente (in qualche minuto) nel sito infiammatorio e rappresentano il segnale precoce che permette il reclutamento delle cellule dendritiche o dei loro precursori.

Si tratta di molecole lipidiche bioattive, componenti derivati dai batteri come i peptidi formolati, dei componenti del complemento come la frazione C5α, da sostanze antimicrobiche come le defensine.  Altri segnali sono liberati da cellule programmate per la morte cellulare, come le proteine di shock termico (HSP Heat Shock Protein) liberate dalle cellule necrotiche, i nucleotidi intracellulari o l’acido urico.

CATTURA DELL’ANTIGENE (ALLERGENE)

Gli antigeni/allergeni vengono catturati dalle cellule dendritiche e trasportati al loro interno per mezzo dell’endocitosi,  processo mediante il quale quelle sostanze si avvicinano e aderiscono alla membrana citoplasmatica (versante esterno). Nel punto di contatto la membrana forma una invaginazione che aumenta e si approfondisce fino a formare una vescicola (circondata da un frammento della membrana citoplasmatica stessa). La vescicola ingloba fino a circondare completamente il materiale da trasportare. Infine, si stacca del tutto dalla membrana citoplasmatica e, col materiale endocitato, si sposta verso l’interno della cellula.

Possiamo avere nell’ambito della endocitosi

- La fagocitosi:  è un processo mediante il quale la cellula internalizza detriti cellulari, cellule apoptotiche (cellule morte) o micro-organismi. La vescicola contenente il materiale internalizzato viene detta fagosoma. Nell’organismo umano, questo tipo di endocitosi può essere effettuato solo da alcune cellule specializzate (macrofagi, neutrofili e cellule dentritiche).

- La pinocitosi è un processo mediante il quale la cellula ingloba piccole quantità di liquido extracellulare. Le vescicole della pinocitosi hanno un diametro massimo di 150 nm. La pinocitosi rappresenta un importante processo di approvvigionamento dei liquidi (quello necessario per il citosol e quello di recupero dei liquidi persi con l’esocitosi).  Esiste una variante della pinocitosi (macropinocitosi) in cui le vescicole hanno un diametro di 0,5-5 μm.

Gli antigeni solubili sono catturati mediante pinocitosi o macropinocitosi.

Gli antigeni solidi (o particolati ) sono catturati principalmente mediante la fagocitosi.

La macropinocitosi è particolarmente attiva nelle cellule dendritiche. Queste evidenziano una specie di ripiegamento o arruffamento (“ruffing”) della membrana cellulare che va a chiudersi formando un macropinosoma una specie di vescicola.  Il materiale del macropinosoma può poi venir degradato dal proteasoma , oppure riciclato alla membrana cellulare oppure venire inglobato da un endosoma citoplasmatico deputato al processamento antigenico tramite il complesso MCH-II.

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macropinocitosi

La cellula dendritica  può assorbire l’equivalente del suo volume nello spazio di un’ora.

Le cellule dendritiche  immature esprimono numerosi recettori che facilitano l’endocitosi:

. il recettore del mannosio può legarsi a numerose glicoproteine mannosilate espresse da molteplici microorganismi (Candida, Pneumocystis, …)

. i recettori per il frammento costante delle IgG (FcγRI) o delle IgE (FcεRII o CD23) permettono di catturare antigeni associati alle immunoglobuline sotto forma di complessi immuni

. i recettori “scavengers” si legano alle lipoproteine modificate e permettono la loro fagocitosi

. i recettori della famiglia delle Lectine C

. i recettori per i corpi apoptosici

. i recettori del complemento CR3 e CR4

I recettori della famiglia delle lectine C giocano anche questo ruolo.

L’internalizzazione dell’antigene è un processo proprio delle cellule dendritiche immature che diminuisce nel corso della loro maturazione.

Le proprietà generali di endocitosi vengono perse quando le CD  divengono mature.

MATURAZIONE DELLE CELLULE DENDRITICHE (CD)

Dopo aver catturato gli antigeni/allergeni, le CD  migrano nei linfonodi linfatici per acquisire la loro maturazione in quanto solo le cellule dendritiche mature presentano efficacemente gli antigeni/allergeni ai linfociti T.

La maturazione e la migrazione delle CD sono due processi che hanno luogo il più spesso simultaneamente.

La migrazione delle CD immature dai tessuti periferici agli organi linfoidi secondari è possibile ma, in questo caso, esse iniziano un processo di tolleranza.

La maturazione delle CD può essere scatenata dai diversi stimoli già descritti quali

. prodotti batterici o virali o allergenici individuati per mezzo delle PPR, in particolare dai TLR e dai NOD

. citochine infiammatorie

. complessi immuni riconosciuti dai recettori Fc

. molecole della famiglia dei recettori al TNF come le CD40L

. segnali di danno indotti dalla morte cellulare

Questo processo maturativo comprende vari avvenimenti coordinati: cambiamenti della morfologia, del citoscheletro, della mobilità, la perdita della capacità di fagocitosi/endocitosi e di secrezione delle chemochine, super-espressione di molecole di co-stimolazione e di aderenza, la traslocazione di complessi peptide-CMH alla superficie della cellula, la secrezione di citochine che polarizzano gli effettori immunitari.

Quindi

Le cellule dendritiche immature hanno per funzione la cattura dell’antigene. Esse hanno una attività di endocitosi  molto intensa, ma una capacità di presentazione molto debole. La loro superficie esprime poche molecole di MHC e di co-stimolazione.

Le cellule dendritiche mature sono devolute alla presentazione dell’antigene.  Le  cellule dendritiche diventano mature dopo aver ricevuto un “segnale di danno” il più spesso generato dalla risposta innata (secrezione di citochine, attivazione diretta dalle TLR…).

Le cellule dendritiche mature hanno ridotte proprietà di endocitosi, ma, per contro esse hanno una capacità di presentazione molto forte. Esse esprimono alla loro superficie una grande quantità di molecole di MHC e molecole di co-stimolazione (CD80, CD86, CD40).

LA MIGRAZIONE DELLE CELLULE DENDRITICHE (CD) 

Mentre gli agenti patogeni (antigeni/allergeni in questo caso) invadono i tessuti periferici, i linfociti sono concentrati negli organi linfoidi secondari.  Le CD, grazie alla loro proprietà di migrare nel corso della maturazione, fanno da legame tra la periferia e gli organi linfoidi secondari. 

La buona coordinazione tra la maturazione e la migrazione delle cellule dendritiche rappresenta la tappa chiave nella sensibilizzazione dei linfociti. L’attivazione delle cellule dendritiche è seguita da un cambiamento radicale nel repertorio dei recettori di chemochine che essi esprimono, e questo cambiamento permette la loro migrazione dalla periferia  fino al linfonodi linfatici di drenaggio. Pertanto la maturazione è associata alla diminuzione dei recettori di chemochine infiammatorie e alla espressione ex novo di CCR7. Questo recettore riconosce due chemochine CCL19 e CCL21 che sono secrete nelle zone ricche in linfociti T degli organi linfatici secondari. Le cellule dendritiche abbandonano così i tessuti infiammatori ed entrano nella circolazione linfatica che li conduce verso i linfonodi linfatici di drenaggio.  CCR7 è il recettore principale che orienta la mobilizzazione delle cellule dendritiche verso i comportamenti ricchi in linfociti T nei linfonodi.

ATTIVAZIONE DEI LINFOCITI DA PARTE DELLE CELLULE DENDRITICHE (CD)

Le CD mature hanno quindi tutte le proprietà per stimolazione efficacemente i linfociti T.

Dopo aver catturato e processato gli antigeni, esse migrano nelle regioni ricche in T linfociti ed esprimono in grandi quantità alla loro superficie i complessi peptide-CMH come anche molecole di co-stimolazione.  Esse quindi possono liberare ai linfociti T i segnali di attivazione, di proliferazione e di differenziazione che sono loro necessari.

L’interazione tra CD-linfocito implica un dialogo nei due sensi che fa intervenire il riconoscimento del peptide mediante il recettore T (TCR) associato al complesso CD3, le molecole di MHC, le molecole di co-stimolazione e le molecole di adesione .

Le CD intervengono in questo dialogo come attivatori ma anche come regolatori della risposta immunitaria in quanto esse polarizzato i linfociti T orientandoli verso la via di differenziazione la più adatta alla aggressione. Una interazione con le CD mature è necessaria per una sopravvivenza a lungo termine del linfociti T e la loro differenziazione in cellule memoria.


Alcuni di tutti questi aspetti delle cellule dendritiche saranno approfonditi nei successivi file.