ALLERGENI MOLECOLARI - INIBITORI DELLE ALFA-AMILASI

Gli inibitori delle alfa-amilasi, in particolare dei cereali


Le piante hanno sviluppato delle strategie di difesa verso i predatori basate sulla produzione di molecole di natura proteica e non, in grado di inibire l’attività degli enzimi secreti dall’apparato digerente degli insetti e degli animali superiori tra cui anche dell’uomo (Garcia-Olmedo G. et al., 1987 Plant. Mol. Cell. Biol.). Per questo motivo, gli inibitori delle alfa-amilasi espressi nei vegetali rappresentano un potenziale mezzo per indurre resistenza contro parassiti nelle piante coltivate (Sharma H.C. et al., 2000 E.J.Biotechnology).

Gli inibitori proteici dell’alfa-amilasi esogena dei cereali vengono generalmente classificati a seconda della loro struttura quaternaria in: monomerici, dimerici e tetramerici (Feng G.H. et al., 1996 Insect Biochem. Biol.). Sono proteine composte da 120-160 aminoacidi per ogni subunità, e ognuna di queste è molto simile per struttura e peso molecolare. In particolare, ogni subunità ha un peso di circa 12-15 kDa ed ha cinque ponti disolfuro che ne stabilizzano la struttura secondaria (Maeda K. et al., 1983 Biochim. Biophys. Acta). Tuttavia la classificazione di queste proteine è particolarmente complessa soprattutto per il fatto che esse vengono chiamate con nomi diversi in lavori pubblicati da differenti gruppi di ricerca.

Gli inibitori monomerici sono stati ampiamente studiati. La prima proteina ad essere stata isolata mostra una mobilità elettroforetica relativa pari a 0.28 ed è stata nominata WMAI-1. Successivamente sono state isolate altre proteine che hanno caratteristiche simili. Due di queste isoforme, indicate come WRP25 e WRP26, differiscono in sequenza l’una dall’altra soltanto per due residui aminoacidici e sono caratterizzati da un’altissima omologia con l’inibitore 0.28. Un’altra isoforma, WRP27, possiede una sequenza distinta da quelle delle ultime due menzionate e bassa omologia anche con lo 0.28, tuttavia un’analisi della velocità di sedimentazione ne ha confermato la natura monomerica (Feng et al., 1995).

Gli inibitori dimerici sono identificati con la sigla WDAI (Wheat Dimeric Amylase Inhibitors) oppure con un numero indicante la loro mobilità in elettroforesi basica. Tra gli omodimeri accertati ci sono tre isoforme: WDAI-1 (0.53), WDAI-2 (0.19) e WDAI-3 (Sanchez-Monge et al., 1989).

Gli inibitori tetramerici vengono spesso identificati con la sigla WTAI (Wheat Tetrameric Amylase Inhibitors), ma sono anche noti con il nome di “CM-proteins” in quanto solubili in miscele di cloroformio e metanolo, utilizzati per l’estrazione dalle farine (Svensson et al., 1999). Attualmente sono conosciute sette subunità denominate CM1, CM2, CM3A, CM3B, CM3D, CM16 (Gomez A. et al. 1989 Proc. Natl. Sci. USA). Di quest’ultima isoforma di 16 kDa esiste una variante omologa glicosilata. Questa N-glicosilazione sembrerebbe implicata nel rendere questo peptide uno degli allergeni inalatori più potenti delle farine di frumento, riconosciuta dalla maggior parte delle IgE dei soggetti affetti da asma del panificatore (Sanchez-Monge et al., 1992).

Tutte le subunità indicate si possono combinare tra loro a formare degli eterotetrameri, ma non tutte le combinazioni sono consentite .

Negli estratti di farina di grano duro (T. turgidum) sono presenti soltanto due isoforme degli inibitori dimerici dell’alfa-amilasi, ossia lo 0.53 e WDAI-3; mentre negli estratti di farina di grano tenero (T. aestivum) è presente anche l’inibitore 0.19: questo infatti è codificato dal genoma D. Gli inibitori dimerici sono gli unici in grado di inibire l’alfa-amilasi proveniente da mammiferi, anche se in modo diverso l’uno dall’altro.

Per esempio, l’inibitore 0.19 sembra essere quello con spettro d’azione più ampio, infatti è attivo contro alfa-amilasi di mammifero come quella salivare umana (HSA) e pancreatica porcina (PPA), oltre che contro amilasi da diversi tipi di insetti (tra cui Tenebrio molitor) e batteri (Bacillus subtilis). Ha un peso molecolare di 26.6 kDa ed è costituito da due subunità identiche di 13.3 kDa, ciascuna composta da 124 amminoacidi (Oneda H. et al. J. Biochem, 2004).

L’inibitore 0.53 sembra essere anch’esso attivo contro alfa-amilasi derivanti da mammifero, ma in misura minore rispetto a 0.19, soprattutto per quel che riguarda la PPA, nonostante abbiano una omologia di sequenza del 94% (Svensson B. et al., Biochim. Biophys. Acta 2003; Franco O.L. et al., Eur. J. Biochem. 2000). Alcuni lavori di letteratura riportano che l’inibitore 0.53 ha la capacità di agire contro alfa-amilasi di molti tipi di insetto (come Callosobruchus maculatus, Zabrotes subfasciatus, Acanthoscelides obtectus e Tenebrio molitor) e, in base a questa sua peculiarità, viene indicato come proteina idonea da far esprimere in piante geneticamente ingegnerizzate per fornire protezione contro i parassiti, senza però fungere da fattore antinutrizionale per i consumatori di tali piante, in particolare per l’uomo (Franco O.L. et al., Eur. J. Biochem. 2000).

Tuttavia, bisogna tuttavia tenere presente che queste proteine sono non solo possono agire come fattori antinutrizionali per i mammiferi e per l’uomo (Svensson B. et al., Biochim. Biophys. Acta 2003) ma posseggono anche un’altra attività biologica: sono i maggiori allergeni implicati nella malattia professionale, nota come asma del panificatore (Franco O.L. et al., Eur. J. Biochem. 2000).

da www.dbt.univr.it

2005