04M - LA SENSIBILIZZAZIONE - IL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA' - I^

IL COMPLESSO MAGGIORE DI ISTOCOMPATIBILITA’

I suoi geni e i suoi prodotti

di Vasco Bordignon


Come vedremo, l’importanza del MHC dipende dal fatto che da esso si producono due tipi principali di molecole, dette di classe I e di classe II, le quali discriminano,  fra diversi pool di proteine antigeniche, gli antigeni citosolici intracellulari e gli antigeni extracellulari che sono stati  fagocitati, presentandoli poi rispettivamente ai linfociti T citotossici CD8+  e ai linfociti T helper CD4+ (che descriveremo più avanti).


DA RICORDARE 

Con il termine  gene si intende un segmento di DNA univocamente identificabile nel genoma che codifica per una proteina o per un RNA, e che può esistere sotto forma di sequenze leggermente diverse (gli alleli).

Il termine locus genico (o più semplicemente locus, plurale loci) designa la posizione di un gene o di un'altra sequenza significativa all'interno di un cromosoma.

In genetica si definiscono alleli le due o più forme alternative dello stesso gene che si trovano nella stessa posizione su ciascun cromosoma omologo (locus genico). Gli alleli controllano lo stesso carattere ma possono portare a prodotti quantitativamente o qualitativamente diversi.

Un locus può essere occupato da uno qualsiasi degli alleli del gene. Le cellule diploidi o poliploidi possono essere definite omozigoti se possiedono il medesimo allele nello stesso locus in ogni cromosoma, o eterozigoti, se possiedono diversi alleli nei loci corrispondenti.

Per ceppo inbred si intende una popolazione costituita da individui, ad esempio topi, identici tra loro geneticamente. Tale ceppo si ottiene incrociando per almeno venti volte la prole derivante da successive generazioni.

allogènico : riferito a tessuti o organi trapiantati o innestati che, pur appartenendo alla stessa specie, presentano caratteristiche diverse da quelle del ricevente (contrapposto  a isogenico).

isogenico: riferito in genetica, a cellule, cloni o individui che presentano lo stesso genotipo o particolari loci genetici identici.

alloantisiero : antisiero diretto contro antigeni di un altro individuo della stessa specie e prodotto in quella stessa specie: per es. il siero prodotto in un ceppo inbred di una specie contro un altro ceppo inbred della stessa specie.

 alloantigene : forme diverse (alleliche) di un antigene codificate dallo stesso locus genetico in tutti gli individui di una specie: per es. gli antigeni di istocompatibilità sono codificati dallo stesso locus ma variano da un individuo all'altro. 

alloanticorpo: anticorpo diretto verso un alloantigene.


LA SCOPERTA DELL’MHC NEL TOPO

Negli anni ’40 George Snell e coll. applicarono le tecniche genetiche per studiare in laboratorio il rigetto di tumori e di altri tessuti trapiantati tra ceppi diversi di topi.

Per poter attuare tale studio, dovettero per prima cosa produrre un ceppo di topi inbred, facendo accoppiamenti ripetuti tra fratelli.  Dopo circa 20 generazioni ciascun topo di un ceppo inbred possiede in tutti i loci dei suoi cromosomi sequenze nucleotidiche identiche, quindi ogni topo inbred  è omozigote in ogni locus genico  e ogni topo di ceppo inbred è geneticamente identico (=singenico) ad ogni altro topo dello stesso ceppo.

Esperimenti di trapianto cutaneo hanno mostrato come i trapianti tra animali di un ceppo inbred vengono accettati, mentre i trapianti da animali di ceppi inbred diversi  vengono rigettati.  Se ne deduceva che il riconoscimento di un trapianto come self o estraneo (non self) dipendeva da un carattere genetico ereditario.

I geni responsabili di questo fatto sono stati chiamati geni di istocompatibilità.  

Per la conoscenza di questi geni si utilizzarono l’incrocio e l’analisi dei discendenti, strumenti della genetica classica.

Fu la creazione di ceppi di topi congenici (in due ceppi congenici  tutti i topi sono identici in tutti i loci eccetto uno, che è quello nei confronti del quale sono stati selezionati per essere differenti) a dare la svolta  definitiva. Infatti l’analisi dei topi congenici , che erano stati selezionati per la loro abilità nel rigettare trapianti  da uno all’altro, indicava  che una singola regione genetica era primariamente responsabile del rapido rigetto del trapianto e questa regione venne chiamata il locus maggiore d’istocompatibilità.  Questo locus particolare identificato da Snell e coll. era legato  ad un gene, sul cromosoma 17, che codificava per un antigene polimorfo del gruppo sanguigno chiamato antigene II. Per questo, tale regione venne chiamata di istocompatibilità-2, o semplicemente H-2.

Mentre inizialmente si ipotizzava che tale locus contenesse un singolo gene controllante la compatibilità tra tessuti, successivamente, a seguito di eventi occasionali di ricombinazione all’interno del locus H-2 durante l’incrocio di ceppi inbred, si comprese che questa regione conteneva numerosi e differenti geni, tra loro strettamente legati, ciascuno coinvolto nel rigetto del trapianto. 

Tale regione venne chiamata il complesso maggiore di istocompatibilità o MHC.

Furono identificati anche altri geni che contribuiscono al rigetto del trapianto ma in modo minore e a questi fu dato il nome di geni del complesso minore di istocompatibilità.

Per quasi 20 anni all’MHC fu dato il solo ruolo di regolare il rigetto del trapianto.

Negli anni ’60 e ’70 si documentò l’importanza fondamentale dell’MHC in tutte le risposte immunitarie verso gli antigeni proteici. Gli studi di Baruj Benacerraf , Hugh McDevitt e altri evidenziarono come ceppi inbred di cavie o di topi si diversificavano nella capacità di produrre anticorpi contro semplici polipeptidi di sintesi e che questa capacità era ereditata come un carattere dominante mendeliano.

I geni responsabili, chiamati geni della risposta immune (Ir), trovati  tutti nell’MHC, codificano per molecole MHC che possono oppure no legare e presentare i peptidi derivati dagli antigeni proteici, per successive importanti reazioni immunologici che vedremo più avanti.

 La prova definitiva dell’importanza basilare delle molecole MHC avverrà con la scoperta del fenomeno della restrizione MHC. (vedi oltre).

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immagine comparativa MHC nell'uomo e nel topo


LA SCOPERTA DELL’MHC NELL’UOMO

Jean Dausset, Jean van Rood e altri studiosi scoprirono che i pazienti che avevano rigetto per il trapianto di rene o avevano reazioni alla trasfusione di leucociti, possedevano, con una certa frequenza, nel loro siero anticorpi che reagivano con antigeni espressi sui leucociti del sangue o sulle cellule dell’organo donatore.

I sieri che possedevano anticorpi diretti contro gli antigeni espressi dai leucociti del sangue di individui allogenici  furono chiamati allosieri, gli anticorpi alloanticorpi e relativi antigeni alloantigeni.

Furono eseguite numerose ricerche in numerosi sieri capaci di legarsi ai linfociti provenienti da donatori diversi e di lisarli. Tali ricerche hanno consentito l’identificazione di numerosi loci genetici polimorfi, raggruppati insieme in una regione situata sul cromosoma 6, i cui prodotti vengono riconosciuti dagli alloanticorpi.

Poiché questi alloantigeni vengono espressi sui leucociti umani , vengono chiamati antigeni leucocitari umani (HLA). 

 

LA STRUTURA DELL’MHC NELL’UOMO

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I geni HLA di classe I e di classe Il sono localizzati in regioni differenti del complesso HLA. 

Il complesso MHC dell'uomo, denominato anche HLA, comprende 4 milioni di coppie di basi di DNA sul braccio corto del cromosoma 6 ed è suddiviso in tre regioni (figura sovrastante).

La regione della classe I, localizzata all'estremità del complesso nella zona distale al centromero, contiene sei geni che codificano le molecole HLA di classe I, e altri geni non funzionali e frammenti genici.

Vi sono tre classi principali di geni di classe I, chiamati HLA-A, HLA-B e HLA-C. Ognuno di questi codifica la catena α della rispettiva molecola HLA , mentre l’altra subunità , la catena leggera invariante di queste molecole di classe I, non è localizzato nel complesso HLA, ma sul cromosoma 15.  Altri geni minori di classe I sono HLA-E, HLA-F, HLA-G.

All'altra estremità del complesso si trova la regione della classe II, la quale è rappresentata da vari geni che vedremo successivamente nella processazione degli antigeni:

 - dai geni codificanti per le catene α e β, denominati A e B, rispettivamente,  HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DQA1, HLA-DQB1

- dal singolo gene codificante per la catena α, HLA-DRA e quattro differenti geni codificanti per le catene β, HLA-DRB1, HLA-DRB3, HLA-DRB4 e HLA-DRB5 e diversi geni non funzionali;

- dai geni dei trasportatori di peptidi TAP1 e TAP2

- dal gene del LMP che codifica subunità del proteasoma;

- dai geni DMA e DMB codificanti le catene DMα e DMβ;

- dai geni DOA e DOB che codificano le catene α e β della molecola DO;

- dal gene TAPBP che codifica la tapasina

Le regioni della classe I e della classe II sono separate da una regione di circa 1 milione di coppie di basi, definita regione della classe III oppure MHC centrale, una zona ad alta densità di geni che non contiene però geni codificanti per molecole HLA di classe I e II.

La particolare combinazione di alleli HLA presenti su uno specifico cromosoma 6 è conosciuta come aplotipo.

Vi sono geni delle molecole MHC di classe I e II che hanno numerosi alleli e quindi anche numerose differenze: questi geni vengono definiti geni polimorfici.

Vi sono geni MHC di classe I e II che non presentano polimorfismi e che vengono chiamati geni monomorfici, e se hanno pochi alleli, geni oligomorfici.

Conseguentemente se i bambini ereditano dai propri genitori alleli diversi di un gene, si parlerà di eterozigosi; se invece ereditano lo stesso allele da entrambi i genitori, si parlerà di omozigosi.

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Nonostante ci siano non più di poche centinaia di alleli per ogni singolo gene HLA (vedi figure sovrastanti), nel corso dell'evoluzione della specie umana essi hanno ricombinato tra loro, dando origine a molte migliaia di differenti aplotipi.

La combinazione di due aplotipi HLA in un individuo può significare, quindi, milioni di differenti combinazioni aplotipiche presenti nella popolazione umana.

La regione dei geni della classe II dell’MHC, come già indicato, comprende i geni che codificano le proteine cooperanti nei processi di elaborazione e presentazione dell’antigene.  Questi geni sono regolati dalle citochine IFN-α, -β e –γ, prodotte nei siti di infezione.

L’espressione dei geni che codificano per HLA-DM, HLA-DP, HLA-DQ, HLA-DR e catena invariante è coordinata dalla citochina IFN-γ.  La trascrizione di questi geni viene attivata da un fattore noto come transattivattore delle molecole MHC di classe II (CIITA, MHC class II transactivator), il cui gene è ugualmente regolato dall’IFN-γ.

 

LE MOLECOLE DELL’MHC nell’uomo

Nell'uomo, le molecole MHC di classe I e II sono anche denominate, rispettivamente, molecole HLA di classe I e II, che sono codificate da geni stabili, in quanto non subiscono riarrangiamenti né altri processi di cambiamento nella linea germinale o somatica.

La diversità ereditata delle molecole MHC è dovuta a due elementi:

* l’esistenza di famiglie geniche, cioè di geni multipli, simili tra loro, che codificano per la catena pesante delle molecole MHC di classe I e per le catene α e β delle molecole MHC di classe II;

* la presenza di un polimorfismo genetico, che determina nella popolazione la presenza di più forme alternative di un gene.

I prodotti dei vari geni della famiglia delle molecole MHC di classe I e II sono definiti isotipi.

Le forme alternative di qualsiasi gene sono chiamate alleli, e le proteine da questi codificate si chiamano allotipi.

Quando consideriamo la diversità delle molecole MHC di classe I e II che si origina dalla combinazione di geni e alleli multipli, il termine isoforma può essere utilizzato per indicare una particolare proteina MHC.

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Nell'uomo ci sono sei isotipi di molecole MHC di classe I, denominati HLA-A, HLA-B, HLA-C, HLA-E, HLA-F e HLA-G, e cinque isotipi di molecole MHC di classe II, definiti HLA-DM, HLA-DO, HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR (vedi figura sovrastante).

Degli isotipi di classe I, HLA-A, HLA-B e HLA-C sono altamente polimorfici e la loro funzione è quella di presentare gli antigeni alle cellule T CD8 e formare Iigandi per i recettori delle cellule NK.

HLA-E e HLA-G sono oligomorfici e formano Iigandi per i recettori delle cellule NK.

HLA-F sembra essere monomorfico, è espresso solo a livello intracellulare e la sua funzione è sconosciuta.

Il polimorfismo presentato dalle molecole HLA-A, HLA-B e HLA-C è una proprietà della catena pesante, essendo la β2-microglobulina monomorfica.

Anche gli isotipi delle molecole MHC di classe II mostrano un ampio spettro di proprietà.

Le tre molecole più polimorfiche, HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR, sono quelle che presentano gli antigeni peptidici direttamente alle cellule T CD4, mentre le molecole oligomorfiche HLA-DM e HLA-DO svolgono la funzione di regolare ìl caricamento del peptide delle molecole HLA-DP, HLA-DQ e HLA-DR.

Entrambe le catene α e β contribuiscono a determinare la diversità degli isotipi delle molecole HLA di classe II polimorfiche.

Nella molecola HLA-DR la catena α non contribuisce quasi alla diversità, mentre la catena β è altamente polimorfica. Le catene α e β delle molecole HLA-DP e HLA-DQ sono entrambe polimorfiche.

In generale, si riscontra una più elevata diversità nelle molecole HLA di classe I rispetto a quella osservata nelle molecole HLA di classe II.


LE MOLECOLE dell’MHC di classe I (HLA-I) 

Le molecole HLA-I si trovano espresse sulle membrane di tutte le cellule nucleate. La loro densità varia a seconda del tipo cellulare: si osserva una forte densità (105 per cellula) sui linfociti, monociti/macrofagi; una densità intermedia (104 ) sulle cellule endoteliali ed epiteliali; una densità nulla o scarsa sulle cellule del pancreas, delle ghiandole salivari, sugli epatociti, sulla cornea, sui globuli rossi. La densità di espressione può aumentare in un contesto infiammatorio.

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Le molecole di classe I sono formate da 2 catene polipeptidiche  legate non covalentemente:

  • una catena α, polimorfa,  codificata dall’MHC  di 44-47 kDa
  • una sub-unità, non polimorfa,  non codificata dall’MHC, di 12 kDa chiamata β2-microglobulina.

La catena α è caratterizzata da tre domini esterni (α1, α2, e α3) ciascuno lungo approssimativamente 90 aminoacidi; da un dominio trans-membrana cellulare di circa 25 aminoacidi idrofobici, cui fa seguito un segmento citoplasmatico di 30 aminoacidi.

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I segmenti amino-terminali (N-terminali)  α1 e α2  della catena α, realizzano una piattaforma costituita da un foglietto β di filamenti antiparalleli che sostengono 2 nastri paralleli di α-elica.

Questa struttura rappresenta la tasca capace di legare i peptidi. Tale tasca ha una larghezza sufficiente a legare peptidi di 8-11 aminoacidi; inoltre ha le estremità chiuse in modo tale da non poter alloggiare peptidi più grandi.

I residui polimorfi delle molecole di classe I sono posizionati nei domini α1 e α2, contribuendo alla variabilità dei diversi alleli di classe I  e responsabili del legame dei peptidi e del riconoscimento da parte de linfociti T.

Il segmento α3 della catena α si situa in un dominio Ig (dominio immunoglobulinico), la cui sequenza aminoacidica viene conservata in tutte le molecole di classe I. Tale segmento contiene un’ansa che rappresenta il sito di legame per il CD8.

Alla estremità carbossi-terminale di questo segmento α3, vi è una sequenza di cica 25 aminoacidi idrofobici che attraversa il doppio strato lipidico della membrana plasmatica. Segue poi nel citoplasma una sequenza di circa 30 aminoacidi che interagiscono con gruppi fosfolipidici del foglietto interno del doppio strato lipidico della membrana plasmatica fissando le molecole MHC alla membrana plasmatica stessa.

La β2-microglobulina, così chiamata per le sue dimensioni e per la sua mobilità elettroforetica (β2)e per la sua solubilità (globulina) interagisce non covalentemente con il segmento α3 della catena α, e come quest’ultima è strutturalmente omologa ad un dominio Ig  e non varia in tutte le  molecole di classe I.

 

Una molecole MCH di classe I completamente assemblata è un eterodimero composto da una catena α, da una β2-microglobulina e da un peptide antigenico legato.  Tutte e tre le componenti dell’eterodimero sono necessarie per l’espressione stabile delle molecole di classe I sulla superficie cellulare.

 

LE MOLECOLE MHC di CLASSE II (HLA-II)


Le molecole HLA-II si trovano espresse solo sulle membrane di alcune cellule  del sistema immunitario: cellule dendritiche, monociti/macrofagi e linfociti B (quindi sulle cellule “professionali” che presentano l’antigene). I linfociti T quiescenti non esprimono HLA-II; la loro espressione è indotta quando queste cellule sono attivate. Le cellule epiteliali ed endoteliali non esprimono queste molecole quando sono allo stato basale, ma possono esprimerle in un contesto di infiammazione.


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Le molecole MHC di classe II sono costituite da due catene polipeptidiche associate in modo non covalente:

  • una catena α di 32-34 kDa
  • una catena β di 29-32 kDa (fig.4-6)

Entrambe queste catene sono codificate da geni MHC polimorfi.

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I segmenti  aminoterminale della catene α1 e β1 contribuiscono alla formazione della tasca per il legame con il peptide. Questa tasca è strutturalmente simile a quella della molecole di classe I.

Quattro stringhe del pavimento della tasca e una delle eliche sono formate da α1 e le altre quattro stringhe  del pavimento e la seconda elica sono costituite da β1. I residui polimorfi  sono localizzati in α1 e β1 , all’interno e intorno alla tasca per il legame del peptide. Il polimorfismo maggiore è espresso dalle catene β. 

In queste molecole di classe II le estremità della tasca sono aperte  e così possono alloggiare peptidi di 30 e più residui.

I segmenti α2 e β2 delle molecole di classe II sono ripiegate, come le precedenti, in domini Ig  che non variano tra i vari alleli di un particolare gene di questa classe.

Un’ansa del segmento β2 fa da sito di legame per il CD4, in analogia a quanto scritto per le molecole di classe I.

Le estremità carbossi-terminali dei segmenti α2 e β2 proseguono in piccole catene di connessione seguite da segmenti di residui transmembrana idrofobici composti da circa 25 aminoacidi. Le regioni transmembrana terminano con residui di aminoacidi basici, seguiti da una breve coda citoplasmatica idrofila.

Un polipeptide non polimorfo chiamato catena invariante ((Ii ) viene associato con le molecole di classe II di nuova sintesi. Questa catena invariante è fondamentale nel traffico delle molecole di classe II e nel determinare il sito all’interno della cellula dove i peptidi si legano alle molecole di classe II. 

La molecola di classe II completamente assemblata è un eterotrimero composto da una catena α, da una catena β, e da un peptide antigenico legato. L’espressione stabile delle molecole di classe II sulla superficie della cellula richiede  la presenza di tutte e tre le componenti di questo eterotrimero.


Fonti documentali : alla fine del successivo file.